人尿源性诱导多能干细胞在遗传病治疗中的应用前景

遗传病传统的临床治疗方法只能减轻或矫正患者的临床症状,不能改变患者携带的致病基因。揭示遗传病的发病机制,利用基因治疗改变细胞中的遗传物质是根治遗传病的有效途径。干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能特性的细胞,其中人尿源性诱导多能干细胞具有容易获得、易于培养增殖、重编程率高等优点,且可被诱导分化为多种细胞和器官。该文总结了近五年来人尿源性诱导多能干细胞的高效重编程方法,并整理其在心脏、肌营养不良、脊髓型肌萎缩等相关遗传病的疾病模型复制、机制探索及可行性治疗方面的应用,为遗传病的临床治疗研究提供更多的思路。

人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

背景:传统尿路修复重建手段受限于供体短缺、并发症多以及生理功能恢复不理想等问题,组织工程策略为此领域提供了新方向。鉴于尿路主要由肌性组织构成,其中关键在于发掘适合的种子细胞并高效诱导分化为平滑肌细胞,但关于不同平滑肌细胞诱导方案效能的对比研究仍较为匮乏。目的:旨在分离、培养及鉴定人尿源性干细胞,并比较两种不同成平滑肌诱导方案的效果。方法:采用多次离心法从11份健康成人志愿者尿液中分离提取尿源性干细胞,使用流式细胞仪进行表面标志物的鉴定,通过成骨、成脂诱导分化来验证尿源性干细胞的多向分化潜能。尿源性干细胞分别在含转化生长因子β1以及转化生长因子β1联合血小板衍生生长因子的成平滑肌细胞诱导分化培养基中诱导分化14 d,采用免疫荧光染色和Western blot检测平滑肌特异性蛋白(α-SMA、SM22)的表达差异。结果与结论:①成功从8份健康人尿液中分离出尿源性干细胞,细胞呈“米粒”样,具有很好的分裂增殖能力;②尿源性干细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90和CD44,极低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45,不表达CD19、CD105和HLA-DR;③经成骨和成脂诱导分化后,可见明显的钙结节和脂滴形成,茜素红染色和油红O染色结果呈阳性;④成平滑肌诱导培养14 d,免疫荧光染色显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组尿源性干细胞成平滑肌诱导分化率显著高于转化生长因子β1组(P<0.005);⑤成平滑肌诱导培养14 d,Western blot检测显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组α-SMA和SM22蛋白表达量显著高于转化生长因子β1组(P<0.005)。结果表明:尿源性干细胞可以通过多次离心法无创分离获取;相较于单纯转化生长因子β1,转化生长因子β1/血小板衍生生长因子联合应用能显著提高尿源性干细胞诱导分化为平滑肌细胞的效率。

肌源干细胞通过TGF-β1/CTGF信号通路减轻压力性尿失禁大鼠的排尿障碍和尿道损伤

目的基于转化生长因子β1/结缔组织生长因子(TGF-β1/CTGF)信号通路探究肌源干细胞(MDSCs)对压力性尿失禁(SUI)大鼠排尿功能和尿道损伤的影响。方法分离、培养MDSCs,免疫细胞化学法检测MDSCs标志物Desmin和Sca-1表达。40只SD雌性大鼠按照随机数字表法分为4组:NC组(不作任何处理)、SUI组(SUI模型)、MDSCs组(SUI模型+MDSCs治疗)、MDSCs+SB431542组(SUI模型+MDSCs治疗+通路抑制剂SB431542处理),每组10只。比较4组大鼠喷嚏阳性率、尿动力学指标[膀胱最大容积(MBC)、漏尿点压(LPP)、腹压漏尿点压(ALPP)、排尿量、残余尿量、排尿效率];HE染色观察4组尿道组织病理学变化;蛋白免疫印迹法检测4组尿道组织中TGF-β1、CTGF蛋白表达。结果成功获得Desmin和Sca-1均呈阳性表达的MDSCs。与NC组比较,SUI组喷嚏阳性率、MBC、LPP、ALPP、排尿量、残余尿量均增加,排尿效率、TGF-β1和CTGF蛋白表达均降低(P<0.05),伴有严重尿道损伤;与SUI组比较,MDSCs组喷嚏阳性率、MBC、LPP、ALPP、排尿量、残余尿量均降低,排尿效率、TGF-β1和CTGF蛋白表达均增加(P<0.05),尿道损伤减轻;与MDSCs组比较,MDSCs+SB431542组喷嚏阳性率、MBC、LPP、ALPP、排尿量、残余尿量均增加,排尿效率、TGF-β1和CTGF蛋白表达均降低(P<0.05),尿道损伤加重。结论MDSCs可改善SUI大鼠的排尿功能,减轻尿道损伤,其可能是通过调控TGF-β1/CTGF信号通路发挥作用。

尿源性干细胞及其外泌体对各系统组织损伤修复的研究进展

目的:探究尿源性干细胞(USCs)在泌尿系统损伤与对其它系统的影响作用及其在组织工程方面的应用潜力。方法:以“尿源性干细胞”为关键词进行文献搜索,分析总结其生物学特性,包括增值能力和多向分化潜能以及对损伤修复的机制,评估USCs在泌尿系统损伤修复和其他领域的应用可能性。结果:尿源性干细胞具有间充质干细胞的生物学特性,并具有简单取材与较强的增值和多向分化能力。研究显示USCs可能起源于肾脏,可以通过释放外泌体与多种细胞因子等对泌尿系统损伤的进行修复,对再生医学与组织工程的研究提供了理想的“种子细胞”。结论:国内外大量研究表明尿源性干细胞的研究前景广阔,其在多个领域的应用潜力巨大,特别是在泌尿系统损伤修复方面,USCs显示出重要的研究价值和临床应用的潜力。Objective: To investigate the effects of urogenic stem cells (USCs) on urinary system injury and other systems and their potential application in tissue engineering. Methods: Using “urogenic stem cells” as the keyword, the literature search was conducted to analyze and summarize their biological characteristics, including the value-added ability, multi-differentiation potential and the mechanism of injury repair, so as to evaluate the application possibility of USCs in the repair of urinary system injury and other fields. Results: The urine-derived stem cells had the characteristics of mesenchymal stem cells, simple sampling and strong ability of multiplication and multidirectional differentiation. Studies have shown that USCs may originate in the kidney and can repair the damage of the urinary system by releasing exosomes and a variety of cytokines, providing an ideal “seed cell” for the research of regenerative medicine and tissue engineering. Conclusion: A large number of studies at home and abroad show that the research prospect of urogenic stem cells is broad, and their application potential in many fields is great. Especially in the repair of urinary system injury, USCs shows important research value and clinical application potential.

甘草干姜汤对人肾癌细胞及人尿源性干细胞的作用

目的:探讨甘草干姜汤(LDGD)对体外培养的人肾癌769-P细胞和人尿源性干细胞(hUSCs)活力和凋亡的作用。方法:常温离心法从人的新鲜尿液中分离培养hUSCs,观察hUSCs的生长状态并采用MTT法测定其活力;流式细胞术鉴定hUSCs表面标志物的表达。MTT法检测2.5~40 mg/mL LDGD作用769-P细胞和hUSCs 24~72 h后的活力,观察其细胞形态的变化;流式细胞术检测10 mg/mL LDGD诱导769-P细胞和hUSCs凋亡的情况,计算其凋亡率。结果:通过常温离心法获得细胞形态良好、生长活性较高的hUSCs,hUSCs表达间充质干细胞表面标志物CD44和CD90,不表达内皮细胞表面标志物CD31和造血干细胞表面标志物CD34。5~10 mg/mL LDGD作用24~72 h可抑制769-P细胞活力并呈时间和剂量-效应关系,而对hUSCs活力有促进作用。10 mg/mL LDGD作用48 h后,倒置显微镜下可见769-P细胞发生明显皱缩,体积缩小,细胞折光率下降,而hUSCs形态无明显变化。10 mg/mL LDGD作用769-P细胞48 h后的凋亡率为(11.93±0.51)%,相较对照组显著升高(P<0.01),而作用hUSCs后的凋亡率为(0.01±0.10)%,与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05)。结论:在本实验条件下,LDGD可抑制体外培养的人肾癌细胞活力,诱导其凋亡;可促进hUSCs的细胞活力,且无明显诱导细胞凋亡作用。LDGD对两种细胞的作用存在明显差异。

CD4^(+)T细胞相关的细胞因子促使由诱导性多能干细胞衍生的中脑星形胶质细胞表现出慢性促炎症表型

星形胶质细胞是维持稳态的介质,但在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中参与神经炎症。越来越多的证据表明外周免疫细胞参与了PD的发病机制。因此,本研究旨在确定外周免疫细胞分泌的细胞因子在调节中脑星形胶质细胞反应性中的潜在作用。人类诱导性多能干细胞(iPSC)衍生的中脑星形胶质细胞暴露于5%和10%的CD4^(+)T细胞条件培养基(CD4CM)24小时、72小时和7天,以评估长期暴露的影响。此外,星形胶质细胞还暴露于Th17细胞细胞因子IL-17A(10 ng/mL),单独或与TNF-α(0.3 ng/mL)结合,在24小时、72小时和7天评估2种细胞因子可能的协同效应。CD4CM在中脑星形胶质细胞中引起了急性及长期的变化。观察到了NFκB向细胞核的转移增加,以及在24小时时促炎基因IL-1β和CXCL10的表达增加;在24小时和48小时时C3、LCN2和IL-6的表达增加;同时在这些时间点促炎细胞因子IL-6和CXCL10的释放也有所增加。IL-17A和TNF-α的组合对增加促炎基因表达和细胞因子释放产生了协同效应。IL-17A和TNF-α在24小时时增加了S100β的强度,在72小时时减少了细胞核面积并增加了星形胶质细胞的圆度。在72小时时观察到了γH2AX强度的协同效应,并且在7天时观察到了乳酸脱氢酶(LDH)释放的增加。我们的结果表明,IL-17A和TNF-α协同作用,增强了中脑星形胶质细胞的反应性,其程度类似于CD4CM。这突出了外周免疫细胞分泌的细胞因子在增强中脑星形胶质细胞反应状态方面的重要性,并提示了它们在PD发病机制中的可能作用。

神经营养素-3过表达诱导多能干细胞治疗糖尿病性勃起功能障碍大鼠的实验研究

目的 探讨神经营养素-3过表达诱导多能干细胞(iPSC-NT-3)对糖尿病性勃起功能障碍(DIED)大鼠的治疗作用。方法 腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠,皮下注射阿扑吗啡对DIED模型进行验证。选择24只造模成功的DIED大鼠,随机分为模型对照组、诱导多能干细胞(iPSC)治疗组和iPSC-NT-3治疗组;腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的8只SD大鼠作为正常对照组。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组分别将iPSC和iPSC-NT-3用微量注射针注射入大鼠阴茎海绵体内,正常对照组和模型对照组同法注射同体积的磷酸缓冲液。治疗后第4周,观察各组大鼠的一般情况,评估性功能和阴茎勃起功能。采用定量聚合酶链反应(q-PCR)和Western blot实验检测神经营养素-3(NT-3)、CD31、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、结蛋白(Desmin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白的表达。结果 治疗前和治疗后4周,模型对照组、iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠体质量和血糖水平的组内、组间差异均无统计学意义(P>0.05)。在大鼠首次爬背时间比较中,模型对照组较正常对照组延长,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组缩短,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);在舔嗅次数、骑跨次数和插入次数的比较中,模型对照组均较正常对照组减少,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组增加,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。在ICP和ICP/MAP的比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA蛋白水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 iPSC-NT-3可通过促进海绵体组织eNOS、血管内皮及平滑肌的生成而改善DIED大鼠的性功能和勃起功能,是一种潜在的治疗DIED的方法。

低氧促进尿源性干细胞迁移与融合能力的作用研究

目的体外实验中探讨低氧对尿源性干细胞(Urine derived stem cells,USCs)迁移及融合能力的影响及该过程中细胞骨架结构和极性的改变。方法常氧(20%)或低氧(3%)条件下培养USCs 48h,应用划痕实验、Transwell实验检测USCs迁移能力;共聚焦显微镜及流式细胞术观察并测定USCs与肝细胞(HP14-19和HepG2)的融合能力;透射电子显微镜及鬼笔环肽荧光探针观察细胞骨架结构;免疫荧光、流式细胞术及Real-time PCR实验检测细胞极性相关蛋白RhoA、Cdc42及Rac1的表达。结果与常氧组USCs相比,低氧组USCs的迁移能力及与HP14-19和HepG2的细胞融合能力明显提升。透射电镜及鬼笔环肽荧光染色可见低氧处理后USCs细胞骨架重塑,微丝微管排列更加有序且规律。免疫荧光、流式细胞术及Real-time PCR结果提示,低氧组USCs极性相关蛋白RhoA、Cdc42及Rac1的表达量较常氧组明显增加。结论低氧处理USCs可促进细胞的迁移及融合能力,其机制可能与细胞骨架的重塑和细胞极性上调有关。

自体来源诱导性多能干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤

背景:干细胞治疗急性肺损伤的研究主要集中在胚胎干细胞和间充质干细胞,有关自体来源诱导性多能干细胞的研究鲜有报道。目的:探讨自体皮肤成纤维细胞来源诱导性多能干细胞尾静脉移植治疗大鼠急性肺损伤的可能性。方法:将24只提取皮肤组织制备诱导性多能干细胞的SD大鼠(北京维通利华实验动物有限公司提供)随机分为3组,对照组腹腔注射生理盐水,模型组和实验组腹腔注射脂多糖制备急性肺损伤模型,造模24 h后,对照组和模型组尾静脉注射PBS,实验组尾静脉注射诱导性多能干细胞悬液。治疗7 d后,观察肺组织形态学、肺组织湿/干质量比、病理损伤程度评分、血清白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平变化。结果与结论:(1)治疗7d后,实验组肺组织损伤明显改善、肺间质水肿减轻、肺泡间隔变薄、毛细血管充血减轻、炎性细胞浸润减少、部分肺泡内的渗出物减少;(2)治疗7 d后,模型组和实验组肺组织湿/干质量比、病理损伤评分明显高于对照组(P <0.01),实验组肺组织湿/干质量比、病理损伤评分明显低于模型组,差异有显著性意义(P <0.01);(3)治疗7 d后,模型组和实验组血清白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P<0.01),实验组血清白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平明显低于模型组,差异均有显著性意义(P <0.01);(4)实验结果表明,自体皮肤成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞移植可有效减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤,降低血清炎性因子水平。

HLA-B2704基因型强直性脊柱炎患者来源的人诱导多能干细胞体系的建立

目的:建立人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-B2704基因型强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者来源的人诱导多能干细胞(human-induced pluripotent stem cells,hiPSCs)体系。方法:采用逆转录病毒介导的感染系统把OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4这4个外源转录因子导入HLA-B2704基因型AS患者的尿液细胞中,重编程获得hiPSCs。通过形态观察、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、内源多能性相关基因检测、体外拟胚体(embryoid bodies,EBs)分化检测、EBs三胚层基因检测以及畸胎瘤形成实验,鉴定获得的hiPSCs。结果:病毒感染尿液细胞后第4天至第5天细胞核质比增大,第14天左右出现克隆,第24天后形成与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)相似的克隆。碱性磷酸酶染色显示,hiPSCs和h ESCs-H1一样,均被染成紫红色,呈阳性。免疫荧光染色显示,h ESCs阶段特异性胚胎抗原4及ESCs转录因子OCT4、SOX2均呈阳性。hiPSCs内源多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和REX1的表达与H1内源多能性相关基因的表达比较,差异均无统计学意义(1.006±0.208,1.000±0.340,t=0.038,P=0.972;1.061±0.140,1.000±0.387,t=0.431,P=0.689;1.386±0.354,1.000±0.032,t=1.467,P=0.303;1.280±0.283,1.000±0.013,t=1.398,P=0.235)。EBs高表达内胚层基因AFP、GATA4,中胚层基因MEX1、TBX1,外胚层基因PAX6、SOX1;EBs三胚层基因AFP、GATA4、TBX1、MSX1、PAX6、SOX1的相对表达量均高于hiPSCs(60.695±8.746,1.000±0.245,t=9.647,P=0.011;3.724±0.144,1.000±0.417,t=12.136,P=0.007;4.224±0.869,1.000±0.130,t=4.988,P=0.038;684.800±63.326,1.000±0.211,t=15.270,P=0.004;131.561±15.785,1.000±0.232,t=11.700,P=0.007;98.507±40.443,1.000±0.215,t=16.000,P=0.004)。hiPSC体内形成畸胎瘤,HE染色可见内、中、外3个胚层的组织细胞;其中内胚层为小肠上皮组织细胞,中胚层为肌肉组织细胞,外胚层为神经上皮组织细胞。结论:采用逆转录病毒介导的感染系统把OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4这4个外源转录因子导入HLA-B2704基因型AS患者的尿液细胞中,经过重编程,可成功建立HLA-B2704基因型AS患者来源hiPSCs体系。

定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化

目的探讨定向诱导人尿液来源诱导性多能干细胞(U-iPS)向多巴胺(DA)能神经元分化。方法单层贴壁法体外培养U-iPS,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,SHH细胞因子,GSK3β抑制剂Chir99021将U-iPS诱导为DA能神经前体细胞(NPCs),通过添加BDNF/GDNF等细胞因子将其进一步分化为DA能神经元。在诱导分化的4个时间点(第0天、7天、14天及25天)采用RT-qPCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;NPCs标志物Nestin、Pax6和Foxa2的表达;DA神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。以人皮肤成纤维细胞来源的iPS(F-iPS)向DA能神经元的诱导分化作为对照进行分化效率的比较。结果U-iPS在第0天表达多能干标志物Oct4和Nanog;诱导第7天能转化为Nestin、Pax6及Foxa2阳性的NPCs;第14天转化为Lmx1a和En1阳性的DA能神经前体细胞;第25天分化得到的神经元样细胞表达神经元标志物Tuj1,其中部分细胞表达DA能神经元标志物TH。各时间点神经类细胞标志物的表达与F-iPS诱导分化得到的神经类细胞标志物的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论U-iPS细胞具有向DA能神经元分化的潜力,能在体外经过诱导分化得到TH阳性的DA能神经元,且与F-iPS向DA能神经元分化的效率无明显差异。

人尿源性干细胞体外向神经元样细胞诱导分化及对大鼠脊髓损伤的保护作用

背景:人尿源性干细胞是近年来新发现的成体干细胞,其来源不受限制,提取简便,具备良好的增殖能力及多向分化潜能,近年来已应用于泌尿系疾病中的神经功能修复,如应激性尿失禁以及膀胱输尿管返流等。目的:探索人尿源性干细胞向神经元样细胞诱导分化能力及对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:体外获取人尿源性干细胞后利用流式细胞仪检测其细胞表型,将人尿源性干细胞向神经元样细胞诱导后进行免疫组织化学染色鉴定。采用Allen方法制作大鼠T9节段脊髓损伤模型,24只SD大鼠被随机分为2组:脊髓损伤组和人尿源性干细胞组,每组12只。人尿源性干细胞组在脊髓损伤后第1天于损伤脊髓边缘注入2μL细胞浓度为1.0×10^11L^-1人尿源性干细胞,脊髓损伤组注入等量含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液,于造模后第1,10,20,30天进行BBB评分,第30天取各组损伤脊髓组织分别进行Luxol Fast Blue染色、小胶质细胞/巨噬细胞染色和胶质纤维酸性蛋白染色,并计算损伤脊髓面积和胶质纤维酸性蛋白荧光强度。结果与结论:①人尿源性干细胞高表达CD29、CD90,而低表达CD45,并且在体外可向神经元样细胞诱导分化;②造模后第1,10天两组大鼠BBB评分差异无显著性意义(P>0.05),第20,30天人尿源性干细胞组BBB评分明显高于脊髓损伤组(P<0.05);③人尿源性干细胞组脊髓损伤面积明显低于脊髓损伤组(P<0.05),胶质纤维酸性蛋白染色显示人尿源性干细胞组荧光强度明显低于脊髓损伤组(P<0.05);④结果表明,人尿源性干细胞能向神经元样细胞分化,并对大鼠脊髓损伤具有修复作用。

尿源性干细胞应用于组织修复的基础研究进展

尿源性干细胞(USCs)是从尿液分离得到的具有强大增殖和分化能力的一类细胞,其来源于肾脏,因与间充质干细胞的众多表面标志物类似,也归为MSCs的一种。USCs能分化为上皮细胞、内皮细胞等多种细胞,在组织工程、再生医学领域显现出巨大潜能。

骨形态发生蛋白2对人尿源性干细胞骨向分化的影响

目的探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)对人尿源性干细胞(hUSCs)骨向分化的影响,并研究其相关机制。方法体外提取hUSCs,利用流式细胞仪检测表型CD29、CD90、CD73、CD44、CD34及CD45;利用10-7~10-5mol/L浓度的BMP2干预hUSCs,Western blot检测骨性标志物碱性磷酸酶(ALP)和Runt相关转录因子2(Runx2);利用基因沉默干扰腺苷酸活化蛋白激酶(si-AMPK),并检测骨性标志物表达。建立大鼠颅骨缺损模型,通过将细胞附着在骨织工程修复支架β-磷酸三钙(β-TCP)植入颅骨缺损模型,1个月后micro CT检测新骨体积和新骨厚度并利用病理学观察新骨结构。结果流式细胞仪检测结果显示,hUSCs高表达CD29、CD90、CD73、CD44,低表达CD34、CD45;并且BMP2在10-6mol/L对hUSCs具有最佳促进成骨效果。Western blot显示,si-AMPK能有效抑制BMP2诱导的骨性标志物ALP和Runx2表达。体内实验结果显示,BMP2能有效促进新骨形成,而si-AMPK能有效抑制新骨形成。结论BMP2在体内外均能有效促进hUSCs骨向分化,可能是通过激活AMPK途径发挥作用。

人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)诱导对人尿源性干细胞(USCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖(ACAN)、SOX-9(SRY-related high mobility groupbox gene 9)、Ⅱ型胶原(COL2)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的mRNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组COL2A1及ACAN荧光表达。结果:培养的USCs成骨、成脂、成软骨三系分化实验结果均为阳性;USCs中干细胞阳性标志物CD29、CD44、CD73和CD90呈高表达,未检出干细胞阴性标志物CD34和CD45。培养14d后倒置显微镜下对照组及NPCs组细胞形态无变化,实验组USCs向髓核样细胞分化,形态变化明显。经共培养诱导14d后实验组及NPCs组中的ACAN、SOX-9、COL2A1及HIF-1α基因mRNA及蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05),ACAN及COL2A1荧光强度明显高于对照组;实验组上述各种mRNA及蛋白表达与NPCs组比较均无统计学差异(P>0.05),实验组荧光强度与NPCs组比较无明显差异。结论:在体外实验中,人NPCs可通过共培养的方式诱导人USCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘组织工程研究提供NPCs来源。

脂肪源性干细胞在女性盆底功能障碍性疾病中的应用潜力

背景:盆底功能障碍性疾病的发病率逐年上升,现有治疗方法存在疗效弊端。干细胞疗法在很多疾病的治疗方面具有巨大潜力,脂肪源性干细胞作为干细胞治疗的种子细胞,具有来源丰富、取材方便、增殖活性高、可多向分化、低免疫原性、易体外培养、能规避诸多伦理问题的独特优势,已成为备选细胞类型之一。目的:针对脂肪源性干细胞的特点、优势及现有研究,讨论其在女性盆底功能障碍性疾病,特别是尿失禁和便失禁中的应用潜力。方法:以“干细胞,脂肪源性干细胞,盆底功能障碍性疾病,压力性尿失禁,便失禁”“stem cells,adipose-derived stem cells,pelvic floor dysfunctions,stress urinary incontinence,anal incontinence”为检索词,检索CNKI、万方数据库、维普、PubMed数据库中发表过的363篇相关文献,通过筛选整理,排除与研究内容无关的文献、重复性研究和过早发表的文献,最终保留了55篇文献进行综述。结果与结论:脂肪源性干细胞依据其获取方便、自我更新快速、低免疫原性、高增殖率、向多谱系分化的潜力,有望为盆底功能障碍性疾病的治疗提供新的突破口。但是由于向临床转化过程中仍存在一些有待解决的问题,例如缺乏标准化的干细胞获取、培养、移植和移植后监测流程及规范,以及现有研究因样本量小、随访时间短等问题,致使脂肪源性干细胞在未来治疗盆底疾病将会是机遇与挑战并存。

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;

人源多能干细胞诱导GABA能神经元移植缓解神经病理性疼痛

神经病理性疼痛给病人带来极大痛苦,且大多数病人对目前的治疗方法都有抵抗。脊髓抑制的减弱是导致神经病理性疼痛的核心因素。已有研究表明胎儿GABA能神经前体细胞可以缓解疼痛,但因其多向分化潜能而不适用于治疗。本研究通过脊髓移植终末分化的人源多能干细胞诱导GABA能神经元(iGABA能神经元),首次证明iGABA能神经元可以显著、长期和安全地缓解小鼠周围神经损伤引起的神经病理性疼痛。此外,移植的iGABA能神经元可以在损伤的脊髓中长期存活并能观察到突触融合。总之,本研究首次为GABA能神经元移植治疗人类神经病理性疼痛提供了有力证据。

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF。

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景:脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。目的:观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。方法:无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。结果与结论:组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及Di I-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。