25-羟基维生素D_3人工完全抗原的合成与鉴定

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。

微囊藻毒素人工完全抗原制备与鉴定

为了研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)的免疫学检测方法,试验制备了MC-LR人工完全抗原,采用水溶性碳二亚胺法将微囊藻毒素的羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基偶联,同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描分析及ELISA等技术对偶联结果进行鉴定与分析。结果表明:微囊藻毒素的羧基与BSA的氨基偶联成功。说明人工完全抗原制备成功,可用于MCLR的免疫学检测。

半抗原直接包被的四环素酶联免疫吸附分析法的建立

为建立更优的四环素(tetracycline,TC)酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),将TC与蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗TC的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)。采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将TC直接包被在酶标板上,并对ELISA反应体系条件进行优化,构建一种半抗原直接包被的TC ELISA检测方法。所制备的MAb特异性良好,交叉反应率低。所构建的检测方法最低检测限IC_(10)值为0.306 ng/mL,半数抑制率IC_(50)值为9.26 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为96.46%~101.89%、96.84%~102.50%。与人工完全抗原包被的检测方法相比(IC_(10)值:0.624 ng/mL,IC_(50)值:28.24 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为93.86%~105.12%、94.04%~105.56%),检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中TC含量的检测,具备良好的应用前景。

氟虫腈单克隆抗体的制备及其在牛乳检测中的应用

合成氟虫腈人工完全抗原,制备氟虫腈单克隆抗体,以氟虫腈及氟虫腈类似物为半抗原,分别采用戊二醛法和碳二亚胺法合成人工完全抗原;利用紫外光谱扫描法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行鉴定;使用氟虫腈-牛血清蛋白人工完全抗原免疫BALB/c小鼠,得到杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生腹水方法制备单克隆抗体;使用酶联免疫吸附测定法测定氟虫腈在牛乳中的加标回收率及精密度。结果表明:氟虫腈的人工完全抗原合成成功,制备的单克隆抗体3F6质量浓度为8.5 mg/mL,效价为2.0×10^(6),亚型为IgG1,与氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的交叉反应率分别为9.21%、14.02%、21.46%;氟虫腈在牛乳中的加标回收率为87%~118%,变异系数低于15%,方法具有较高准确度和精密度。

N-羟乙酰神经氨酸IgY抗体的制备及鉴定

本试验旨在建立N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)IgY抗体的制备及鉴定方法。通过碳二亚胺法将Neu5Gc和载体蛋白进行偶联,制备Neu5Gc人工完全抗原,用制备的完全抗原免疫海兰褐蛋鸡制备Neu5Gc-IgY抗体,经ELISA检测分析鉴定抗体活性。经紫外光谱扫描、琼脂糖凝胶电泳法初步判断Neu5Gc人工完全抗原制备成功,获得的特异性Neu5Gc-IgY抗体经ELISA检测分析,首次免疫后第7天产生抗体,抗体效价呈动态变化,随着免疫次数的增多,血清效价和抗体效价逐步上升,至初次免疫后63d达到高峰,效价达1∶10 000,停止加强免疫后抗体效价可持续一个月左右,1号鸡产生的IgY抗体具有很好的抗原竞争活性,获得竞争回归方程y=30.28x+16.923,线性系数R2=0.9581。以上结果表明,本试验制备的Neu5Gc IgY抗体取得了理想效果,为红肉、牛奶及肿瘤组织中Neu5Gc的检测奠定了基础。

异氰酸酯类代表物人工抗原的合成及鉴定

目的合成异氰酸酯类物质二异氰酸甲苯酯(2,4-TDI),二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)及环己烷二异氰酸酯(HDI)的人工完全抗原,为检测环境中异氰酸酯类物质的免疫分析方法的建立奠定基础。方法将不同浓度TDI,MDI,HDI连接到载体蛋白HSA(人血清白蛋白)和OVA(卵清蛋白)上,采用紫外全谱扫描,三硝基苯磺酸法(TNBS)和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对合成抗原进行鉴定。结果合成的TDI、HDI、MDI完全抗原的紫外吸收光谱、SDS-PAGE电泳条带呈现出与半抗原、载体蛋白不同的吸收峰和条带特性,说明半抗原与载体蛋白偶联成功,TNBS法鉴定结果显示成功合成具有不同偶联比的TDI、HDI、MDI的各3种免疫原和包被原。结论本研究成功合成TDI、MDI、HDI的人工完全抗原,为其免疫测定方法的建立提供了条件。

半抗原直接包被的磺胺二甲氧嘧啶酶联免疫吸附分析法的建立

作为食品中抗生素残留的主要类型之一,传统的磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)常以多克隆抗体和完全抗原包被作为检测基础,可能会出现检测灵敏度低、标准化难等问题。为建立更优的SAs ELISA检测方法,以磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)为研究对象,并将其作为半抗原与大分子蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗SDM的单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)。并采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将SDM直接包被在酶标板上后对ELISA反应体系条件进行优化,构建一种基于MAb的半抗原直接包被的SDM间接竞争ELISA(Indirect competitive ELISA,icELISA)检测方法。所制备的MAb特异性良好,交叉反应率低。所构建的icELISA检测法检测条件为:半抗原包被浓度为0.5μg/mL,抗体稀释比为256000,竞争反应体系温度为25℃,pH7.4,以1%BSA溶液作为封闭剂。该方法最低检测限IC_(10)为0.274 ng/mL,半数抑制率IC50为8.39 ng/mL,水和牛乳中加标回收率分别为97.28%~101.2%、98.34%~101.28%。与同等条件下建立的人工抗原包被的icELISA检测方法(IC_(10):0.579 ng/mL,IC50:22.5 ng/mL,水和牛乳中加标回收率分别为92.08%~105.22%、94.62%~103.76%)相比检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中SDM含量的检测,具有良好的应用前景。