谷氨酸棒杆菌人工核糖体结合位点(RBS)文库的建立与应用

核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)是一种重要的生物控制元件,是实现基因表达精细调控的重要工具,在微生物代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,被广泛应用于多种氨基酸和有机酸的工业化发酵生产。然而目前,关于谷氨酸棒杆菌RBS元件文库的报道仍然较少。该研究基于谷氨酸棒杆菌RBS序列基本特征,设计构建了一个随机RBS文库。利用流式细胞分选技术和96孔板筛选技术,建立了RBS文库高通量筛选方法。通过2步筛选,构建了一个调控范围广,覆盖范围均匀的人工RBS元件文库,调控范围达到29.04倍。利用α-淀粉酶表达系统对构建的人工RBS文库进行测试和表征,结果表明人工RBS文库具有较高的稳定性和通用性。随后该研究将人工RBS文库应用于L-高丝氨酸生物合成途径的调控优化。利用不同强度RBS元件对L-高丝氨酸合成途径关键酶LysCr和Homr进行精细表达调控,获得了具有高效L-高丝氨酸合成能力的最佳组合,L-高丝氨酸产量到达12.7 g/L,比野生型菌株高丝氨酸含量提高了3.6倍。综上所述,该研究构建了一个调控范围广、稳定性高的谷氨酸棒杆菌人工RBS文库,为谷氨酸棒杆菌代谢工程改造和基因精细表达调控提供了有效的控制元件。

基因工程

900573 通过电激作用对类肠膜明串珠菌的质粒转化及其在分子克隆中的用途[英]/David. S. …∥ Appl. Environ. Microbiol.-1989,55(6)-1483～1489[译自DBA,1989,8(15),89-08707] 报道了利用电激对类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)的转化。

基因工程

941288用改进的显示技术(DDRT-PCR)鉴别不同表达的mRNA种类[英]/Bauer,D. …∥NucleicAcids Res.-1993,21(18).-4272～4280[译自DBA,1993,12(22),93-12586] 建立了一种改进方法,差异显示逆向转录PCR,用以广泛地展示表达的基因并检出不同细胞的表达差异。经优化该方法可快速有效地鉴别基因并采用了自动分析系统,应用泛围也扩大了。

基因诱变、重组、克隆

922411 人胃H,K-ATP酶β-亚基的cDNA克隆[英]/Ma,J.…∥Bioehem.Biophys.Res.Commun.-1991,180(1).-39～45[译自DBA,1991,10(25),91-14505] 利用两个寡核苷酸DNA探针(由来自相应的大鼠和家兔ATP酶β-亚基的cDNA序列组成),从人胃粘膜噬菌体λ-gt10基因文库中分离出编码胃H+/K+-转运ATP酶的全长eDNA克隆。将插入序列再克隆到质粒噬菌体pBluescript-Ⅱ-SK+中,测定基因的DNA序列。插入序列长1407bp.编码分子量为33367的291个氨基酸的肽。

谷氨酸棒杆菌乙酰羟酸合酶的高效表达调控及应用

谷氨酸棒杆菌是支链氨基酸工业生产的主力菌,乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是支链氨基酸合成的关键酶,强化AHAS的表达是提高菌种水平的关键手段。然而目前还未实现高效调控AHAS,本研究首先基于前期开发的靶基因表达调控报告系统,从6个组成型强启动子中筛选乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN的高效表达启动子,成功获得P_(gpmA*)启动子,表达强度是PilvBN天然启动子的23.3倍。其次,在P_(gpmA*)启动子基础上,构建并通过平板荧光成像初步筛选了3种人工合成核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)文库,发现“R(9)N(6)”为优势的突变文库,通过进一步的孔板复筛,成功获得36个不同的强度增强的RBS突变体,最高强度可达天然启动子PilvBN的62.3倍。最后,选择P_(gpmA*)启动子分别组合3种RBS(野生型、RBS18和RBS36)调控ilvBNS155F的表达生产L-缬氨酸,L-缬氨酸产量随着表达调控元件强度的增强而提高,分别为1.17、1.38、2.29 g/L。在RBS18调控的基础上进一步组合ilvC过表达,L-缬氨酸产量可达7.57g/L。本研究获得的AHAS表达调控元件库,可为改造AHAS生产L-缬氨酸等支链氨基酸提供丰富元件,并为其他关键酶的表达调控提供思路和方法借鉴。