人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性。方法全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性。脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达。结果正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达。结论采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达。

特异性结合于HBV X基因启动子的人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建人工锌指蛋白(Putative zinc finger protein,ZFP)基因的真核表达载体,验证其在真核细胞内的表达情况,为进一步构建人工转录因子(Artificial transcription domain factor,ATF)所需的DNA结合结构域寻找合适的ZFP。方法:合成ZFP的全基因核酸序列并载入pEGFP-N1真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pEGFP-N1/ZFP-Flag,通过菌液PCR、酶切和测序来鉴定重组质粒的正确性。脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转染于COS-7细胞中,使用RT-PCR、荧光显微镜、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达。结果:成功构建了pEGFP-N1/ZFP及pEGFP-N1/ZFP-Flag重组质粒,并且在COS-7细胞中进行了ZFP的表达。结论:通过生物信息学工具获取的ZFP氨基酸序列,经过密码子优化得到的基因序列能够在真核细胞内成功表达。

人工锌指蛋白介导调控的里氏木霉纤维素酶生产

里氏木霉Trichoderma reesei Rut-C30是目前研究最广泛的纤维素酶生产菌,选育高产纤维素酶的里氏木霉菌株有助于提高木质纤维素资源生物炼制的经济性。利用人工锌指蛋白文库转化T.reeseiRut-C30,筛选获得了两株高产纤维素酶的突变株T. reesei M1和M2,与出发菌株比较,突变株M1和M2滤纸酶活分别提高100%和53%,且M1突变株外泌蛋白量提高69%,M2内切纤维素酶活提高64%。实时定量PCR分析结果表明,与对照菌株相比,突变株M1和M2中主要纤维素酶基因转录均上调,但不同酶基因在两株菌中有不同的变化特征。此外,纤维素酶抑制转录因子基因ace1在两株突变株中都转录下调,而纤维素酶正调控转录因子基因xyr1仅在M1突变株中上调。以上结果表明,不同人工锌指蛋白对纤维素酶活性的影响具有多样性。对这些突变体中人工锌指蛋白靶基因进行深入分析,为进一步深入探究里氏木霉纤维素酶合成调控的机理,以及利用代谢工程选育更高效的产酶菌株提供了基础。

利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株

选育高乙醇耐性的酿酒酵母菌株对提高燃料乙醇的发酵效率具有重要意义。锌指蛋白广泛存在于多种生物中,对基因的转录和翻译起重要的调节作用。利用人工设计的锌指蛋白可定向设计锌指序列及其排列顺序,实现对细胞内多个基因的全局调控。由于与环境胁迫反应相关的基因很多,因此可利用人工锌指蛋白技术获得耐受性提高的微生物重组菌。文中将人工锌指文库转入到酿酒酵母模式菌株S288c,选育了具有高乙醇耐受性的重组菌株M01,并分离了与乙醇耐受性提高相关的人工锌指蛋白表达载体pRS316ZFP-M01,转入工业酿酒酵母Sc4126,在含有不同浓度乙醇的平板上,工业酵母Sc4126的重组菌株表现出显著的耐受性提高。在高糖培养基(250 g/L)条件下进行乙醇发酵,发现重组菌的乙醇发酵效率明显快于野生型,发酵时间提前24 h,且发酵终点乙醇浓度提高6.3%。结果表明人工锌指文库能够提高酵母的乙醇耐受性,为构建发酵性能优良的酵母菌种奠定了基础。