大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期基因表达在抗人巨细胞病毒机制中的作用

目的研究大蒜新素抑制人巨细胞病毒(HCMV)复制的作用环节和机制。方法采用时间依赖的药物添加和移除实验分析大蒜新素在HCMV病毒复制周期中的作用环节。用Southern blot检测大蒜新素处理后感染细胞中HCMV DNA负荷量变化。用Northern blot和Western blot检测大蒜新素对HCMV即刻早期(ie)基因转录和翻译的影响,并与相应浓度更昔洛韦(GCV)的作用效应作比较。结果时间依赖的药物添加和移除实验发现大蒜新素只有在HCMV感染复制周期的早期存在时才能发挥对病毒增殖的抑制作用。大蒜新素对ie 1 mRNA的抑制率达30．4％-46．6％。在感染后24 h 病毒表达IE蛋白的高峰期时,大蒜新素对IE72表达的抑制率为42．6％-64．9％,对IE86表达的抑制率为50．7%- 70．6％。到感染后72 h时(子代病毒表达IE蛋白的时期),大蒜新素对IE蛋白仍然有抑制作用,对IE72的抑制率为 36.4％-49．3％,对IE86的抑制作用更为明显,抑制率达77．9％-87．7％,接近于对IE72抑制率的2倍。而GCV对一个 HCMV复制周期内的ie 1 mRNA和IE蛋白表达均无抑制作用。Southern blot结果显示,在感染后72 h(HCMV完成一个复制周期的时间点),大蒜新素和GCV均能减少HCMV DNA负荷量,两药相当剂量的抑制效应比较,差异无统计学意义(P> 0．05)。结论大蒜新素抑制HCMV ie基因的转录和翻译,进而抑制病毒的复制增殖,是其抗HCMV的重要作用机制。

体外感染后巨细胞病毒即刻早期基因转录及细胞结构变化的研究

目的：研究巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染后即刻早期基因转录及细胞结构的变化。方法：用ＨＣＭＶＡＤ１６９株感染人胚肺成纤维细胞，通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）动态检测感染后不同时间ＨＣＭＶ即刻早期基因（ＩＥＧ）ｍＲＮＡ转录，同时在电镜下观察细胞结构变化的特点。结果：ＨＣＭＶ感染细胞６ｈＩＥＧｍＲＮＡ开始转录，并持续到９６ｈ；感染初期（６～１２ｈ内）胞体肿胀，内质网（ＥＲ）囊腔膨大，１２～２４ｈ可见典型的“猫头鹰眼”样包涵体，细胞变圆，晚期（４８ｈ后）细胞灶性脱落，胞质退缩，ＥＲ少见，核中见待出核的成熟病毒颗粒。结论：ＨＣＭＶＩＥＧ在病毒复制过程中持续转录，并伴有细胞结构的病理变化，因此ＨＣＭＶＩＥＧ可作为病毒活跃复制的监测指标。

即刻早期和晚期基因的转录产物在巨细胞病毒感染中的诊断作用

近年来对于巨细胞病毒 (CMV)的即刻早期 (IE)基因和晚期 (L)基因的结构和功能有了较为深入的研究。应用核酸杂交技术和聚合酶链反应等先进技术检测 IE- m RNA和 L- m RNA能在早期特异性地诊断 CMV活动性感染 ,对于临床治疗和预后监测有重要的指导意义。

即刻早期和晚期基因的转录产物在巨细胞病毒感染中的诊断作用

近年来对于巨细胞病毒 (CMV)的即刻早期 (IE)基因和晚期 (L)基因的结构和功能有了较为深入的研究。应用核酸杂交技术和聚合酶链反应等先进技术检测IE -mRNA和L -mRNA能在早期特异性地诊断CMV活动性感染 ,对于临床治疗和预后监测有重要的指导意义。

人巨细胞病毒即刻早期蛋白1对白血病蛋白致癌基因结构域的作用研究进展

白血病蛋白致癌基因结构域是间期细胞核内的亚核结构域,是DNA病毒入侵、转录及复制的关键部位,其完整性对病毒感染至关重要。早幼粒细胞性白血病蛋白是白血病蛋白致癌基因结构域的主要蛋白,负责维持其他白血病蛋白致癌基因结构域蛋白的正确定位。为DNA肿瘤病毒的人巨细胞病毒即刻早期蛋白可靶向定位白血病蛋白致癌基因结构域,并使早幼粒细胞性白血病蛋白从白血病蛋白致癌基因结构域移出,从而破坏其完整性。研究病毒对白血病蛋白致癌基因结构域的作用有助于阐明该类病毒与细胞转化和肿瘤发生的联系。

人巨细胞病毒即刻早期基因功能研究

目的探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在体外增殖过程中即刻早期(immediately early,IE)基因的作用。方法设计并化学合成3条靶向IE基因外显子序列的siRNA,应用阳离子脂质体法将干扰序列转染入人胚肺成纤维(human embryonic lung fibroblast,HELF)细胞,用HCMV感染已转染入siRNA的细胞,同时设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和转染试剂对照组。采用流式细胞术检测转染效果,荧光定量PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测分析导入的siRNA对IE基因和GAPDH阳性对照基因的抑制效果以及早期(E)基因和晚期(L)基因的表达情况。结果 siRNA成功导入HELF细胞内,6孔板内5μl脂质体可导入的最佳siRNA量约为100pmol,阳性对照组GAPDH表达量较其他对照组有明显的下降(P<0.05),抑制率为70.8%;干扰组中3条siRNA对IE基因的表达均有抑制作用。IE基因表达下调后,E基因和L基因的表达较对照组也有明显下降(P<0.05)。结论在体外,靶向IE基因的siRNA能有效抑制IE基因的表达从而影响E基因和L基因的表达,表明IE基因的有效表达是E基因和L基因表达的基础。

大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期抗原表达的实验研究

目的 :通过研究大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期抗原 (HCMVIEA)的抑制作用 ,探讨大蒜新素体外对HCMV感染的预防、阻断和治疗效应及其机制。方法 :采用细胞形态观察和MTT比色法检测大蒜新素的细胞毒性。以流式细胞术定量检测和比较大蒜新素不同剂量 ,不同处理时间 (2 4 ,4 8,72 ,96h)以及病毒感染不同阶段 (病毒吸附前、吸附时和吸附后 )应用大蒜新素时HCMVIEA表达水平变化。结果 :人胚肺成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度为 9.6 0mg·L-1。病毒吸附后持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ,用药 72hHCMVIEA抑制率达 89.3% ;大蒜新素预处理细胞后感染病毒 ,HCMVIEA抑制率为 2 8.6 % ;药物与病毒吸附同时应用 ,即刻早期抗原 (IEA)抑制率仅为 10 .3%。结论 :大蒜新素体外持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ;其预防作用较弱 ;即时抑制效应不明显。大蒜新素对IEA表达的明显抑制可能是大蒜新素抗HCMV效应的主要作用机制之一。

早期蛋白p52对人巨细胞病毒基因复制作用的实验研究

目的 :探讨HCMVDNA聚合酶辅助蛋白p5 2在病毒基因复制过程中的作用。方法 :采用体外实验方法建立HCMV感染细胞模型 ,在感染后不同时间段 ,FQ PCR法测定细胞内HCMVDNA拷贝数 ,免疫组化法检测病毒蛋白p5 2 ,计算机图像分析系统处理结果。同时光镜观察致细胞病变作用 ,电镜检查其超微结构的改变。结果 :感染后各组细胞内均能检测到HCMVDNA及p5 2表达 ,随感染时间延长 ,二者水平均升高 ,p5 2定位于感染细胞核内。与感染后 12h相比 ,此后各时段p5 2表达量均明显增高 (P <0 0 1) ;而至感染后 48h ,细胞内HCMVDNA量方明显高于感染后 12h(P <0 0 5 ) ,持续到感染晚期 ;同时细胞开始出现病变 ,并随感染时间延长、细胞内p5 2表达水平升高及HCMVDNA量增多而逐渐加重。结论 :早期蛋白p5 2在HCMVDNA复制过程中发挥重要作用 ,可有效促进病毒基因复制。

人巨细胞病毒主要即刻早期抗原的致病机制与治疗

在细胞和分子水平对人巨细胞病毒致病机制的研究发现,主要即刻早期抗原(major immediate early antigen,MIEA)可促进人巨细胞病毒自身的产毒复制、影响宿主细胞基因表达、改变细胞生长周期导致细胞增殖或凋亡,并引发一系列炎症反应,是人巨细胞病毒致病的重要因素。抑制MIEA表达和对抗其功能的治疗显示出潜在优越性和良好的临床应用前景。

人巨细胞病毒微小RNAmiR-UL70-5P靶向抑制人即刻早期反应蛋白3的表达

目的寻找人巨细胞病毒微小RNA mi R-UL70-5P调控的靶m RNA,检测mi R-UL70-5P对靶m RNA蛋白质表达的调节作用。方法采用Hybrid-PCR方法从人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞总RNA中筛选候选靶m RNA;采用荧光素酶实验验证mi R-UL70-5p与候选靶m RNA的结合能力;采用Western blot方法检测转染mi R-UL70-5P对部分靶m RNA蛋白质表达的调节作用。结果筛选并鉴定了人即刻早期反应蛋白3(IER3)等7种靶m RNA可与mi R-UL70-5P特异性结合;在293T细胞中过表达的IER3可以被转染的mi R-UL70-5P下调30%。结论人巨细胞病毒表达的mi R-UL70-5P在病毒感染宿主过程中具备抑制IER3蛋白质表达的能力。

人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展

人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）是一种重要的病毒，属于疱疹病毒科，在普通人群中的感染率为８０％以上，对于某些特殊地区和人群，其感染率可高达１００％。人群感染ＨＣＭＶ后，通常呈隐性感染，但对于孕妇和免疫能力低下者（如器官移植病人、艾滋病患者），该病毒易导致严重...

人巨细胞病毒IE及L基因片段的检出与动脉粥样硬化的关系

以自行设计及合成的两对引物，利用聚合酶链反应，检测了５５份不同类型动脉粥样硬化血管组织中人巨细胞病毒（Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＣＭＶ）的ＩＥ及Ｌ基因片段，阳性率高达５９．９％（３３／５５），而作为对照的正常冠状动脉及大隐静脉却仅为４５％（１／２２），表明ＨＣＭＶ感染与动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ａｓ）的发生密切相关。比较同一组织标本中ＨＣＭＶＩＥ及Ｌ基因的检测结果发现，除个别Ａｓ组织同时可检出ＩＥ及Ｌ基因外，８１．８％的Ａｓ组织ＤＮＡ仅表现为ＩＥ或Ｌ基因阳性，提示ＨＣＭＶ基因组中不同的基因片段在Ａｓ发生发展中可能起着不同的生物学作用。

RNA干扰技术在体外抑制人巨细胞病毒基因表达的应用

目的探讨RNA干扰技术在体外抑制人巨细胞病毒(HCMV)基因表达时siRNA转染和病毒感染的先后顺序对抑制效果的影响。方法设计并化学合成靶向即刻早期(IE)基因的siRNA。应用阳离子脂质体法将siRNA导入人胚肺成纤维(HELF)细胞,并分为先转染siRNA后感染HCMV、先感染HCMV后转染siRNA以及同时转染siRNA和感染HCMV3组,同时设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和转染试剂对照组。采用荧光定量PCR和琼脂糖凝胶电泳方法分别检测分析各组转染的siRNA对IE基因和阳性对照基因GAPDH的抑制效果。结果阳性对照组GAPDH基因mRNA表达量较阴性对照组和转染试剂对照组有明显下降,siRNA抑制率为70.4%,差异有统计学意义(P<0.05)。先转染si RNA后感染HCMV组、先感染HCMV后转染si RNA组、同时转染siRNA和感染HCMV组以及阳性、阴性、转染试剂对照组的IE基因m RNA表达量比较,差异有统计学意义(F=146.93,P=0.000)。其中先转染siRNA后感染HCMV组以及同时转染si RNA和感染HCMV组对IE基因m RNA表达的抑制效果均好于先感染HCMV后转染siRNA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在体外,siRNA能有效抑制靶基因的表达,且先转染si RNA再感染病毒的抑制效果相对更好,提示siRNA对HCMV感染具有一定的预防作用。

人巨细胞病毒感染的早期诊断

人巨细胞病毒是引起器官移植术后患者致病和死亡的重要病原,早期诊断对及时抗病毒治疗至关重要。本文就目前用于人巨细胞病毒感染的早期诊断方法——抗原血症检测;病毒DNA定量检测;病毒基因转录产物检测等作了综述。

异基因造血干细胞移植后人巨细胞病毒再激活的主要分子事件

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)所致的机体免疫缺陷是引起潜伏状态人巨细胞病毒(HCMV再激活的始动因素。allo-HSCT受者HCMV再激活的危险因素包括供受者HCMV血清学状况、人类白细胞抗原(HLA)匹配程度及预处理方式等。HCMV再激活与病毒基因组中主要即刻早期启动子/增强子(MIEP)过表达诱发的系列病毒裂解增殖蛋白的表达相关。本文就引起allo-HSCT术后HCMV再激活的危险因素、维持HCMV潜伏感染相关的分子变化、MIEP过表达在HCMV再激活过程中的关键作用、参与allo-HSCT术后HCMV再激活的分子通路进行综述,探讨allo-HSCT后HCMV再激活的主要分子事件,为allo-HSCT后巨细胞病毒病(CMVD)的防治提供参考。

潜伏人巨细胞病毒的激活机制

人巨细胞病毒感染人体后常呈亚临床感染或潜伏感染,在艾滋病、器官移植和肿瘤等免疫功能低下患者中该病毒常被激活,并出现明显临床表现,甚至是致死性后果。人巨细胞病毒的潜伏激活机制是近几年国内外研究热点,本文就有关研究进展作了综述。

抗家蚕核多角体病毒(BmNPV)即刻早期蛋白基因的三联核酶的设计和性质

以ＢｍＮＰＶＩＥ基因为靶序列，通过计算机设计了３个切割靶序列不同位点的锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）（Ｒ４７、Ｒ２０８和Ｒ６８７）。为了提高核酶的切割效率，把３个核酶串联在一起形成三联的核酶（Ｒ４２６）。为使单个核酶之间不相互干扰，改变了茎区Ⅱ的碱基序列。核酸二级结构计算机模拟显示，这种改变非常成功。为了减少长的侧翼序列对Ｒ４２６的影响，将Ｒ４２６基因光隆到ｐＲＧ５２３质粒的ｃｉｓ－核酶之间，限制性内切酶线性化后，用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶进行体外转录，得到具有短的侧翼序列的Ｒ４２６分子。转录和切割实验表明，Ｒ４２６两侧的ｃｉｓ－核酶的切割效率非常高，释放出的Ｒ４２６能够特异地切割转录和合成的靶序列。说明我们设计的三种核酶的“催化中心”能使３个单价核酶不相互干扰，各自独立发挥切割作用，也不影响其两端的ｃｉｓ－核酶的切割活性。这与实验设计的预期结果完全一致。