先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B基因型研究

目的探讨HCMV感染和gB基因型与先天性心脏病关系。方法2004年9月～2005年6月住院的先天性心脏病患者116人为先心组,其中仅患先天性心脏病者73人,合并肺炎43人,其中男性64人,女性52人,年龄1个月～13岁,平均(1.7±2.0)岁。对照Ⅰ组为同期住院无先天性心脏病而仅患肺炎的患者98人,其中男性57人,女性41人,年龄1个月～14岁,平均(2.3±3.3)岁。对照Ⅱ组为无症状正常婴儿但尿HCMV—DNA检测为阳性,共25人,年龄1个月～12月,平均(6.9±5.3)月。应用荧光定量法检测先心组和对照Ⅰ组尿HCMV—DNA含量,应用套式PCR(nPCR)加限制性长度多态性分析(RFLP)的方法检测HCMV包膜糖蛋白B(glycoprotein B,gB)基因型。结果先心组尿HCMV—DNA阳性率60.3%,对照Ⅰ组尿HCMV—DNA阳性率36.7%,差异有统计学意义(X^2=11.864,P<0.01);年龄1～12月先心患儿体内HCMV gBⅠ型占78.6%(22/28),对照Ⅱ组HCMV gBⅠ型占40.0%(10/25),差异有统计学意义(X^2=8.214,P<0.01)。结论宫内HCMV感染可能是先天性心脏病的致畸因子,gBⅠ型是致病优势基因。

人巨细胞病毒糖蛋白B基因分型与婴幼儿感染致病的相关性研究

目的探讨不同人巨细胞病毒糖蛋白B基因分型与婴幼儿感染致病间的关系。方法临床采集200例婴幼儿感染HCMV血液标本,采用巢式PCR检测130例婴儿肝病综合征患者、33例血小板减少症患者和37例神经性耳聋患者标本中HCMV的gB基因,并通过限制性片段长度多态性分析(RFLP)对gB基因进一步分型。分析HCMV及其不同gB基因型与上述婴幼儿感染致病的关系。结果婴儿肝病综合征患者中gB基因型主要以gB1型为主,占56.9%;血小板减少症患者中gB基因型分布较均衡,各gB分型无特异性;而在神经性耳聋患者中,gB基因型主要为gB4型,占40.5%,其次为gB1型占24.3%。不同gB基因型HCMV感染患者在婴儿肝病综合征和神经性耳聋中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论婴儿肝病综合征和神经性耳聋与HCMV的gB分型密切相关,而血小板减少症无直接关系。

巨细胞病毒糖蛋白B基因型与新生儿感染关系研究

目的:探讨感染新生儿人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B(gB)基因型分布,研究不同HCMV gB基因型致病性的差异。方法:采用巢式聚合酶链反应(nested PCR),限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等测定88例感染患儿尿中HCMV gB基因型,并分析gB基因型与不同临床症状的关系。结果:感染新生儿HCMV 4个gB基因型分布为gB1型占48%,gB2型占27%,gB3型占18%,gB4型占7%。不同gB基因型HCMV感染的临床表现存在差异。结论:4个gB基因型HCMV均能引起新生儿感染,以gB1型为主。不同HCMV gB型感染可导致不同的临床结果。

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。

SE-hBCG对重组巨细胞病毒糖蛋白B及冻干人用狂犬病疫苗免疫原性的影响

目的探讨含角鲨烯的水包油纳米乳剂-热灭活卡介苗(SE-hBCG)对重组巨细胞病毒糖蛋白B(CgB)及冻干人用狂犬病疫苗(Rab)免疫原性的影响。方法选取145只SPF级6~8周龄雌性BALB/c小鼠进行以下实验。实验1:取25只小鼠,分成SE组、SE-hBCG组、CgB组、SE+CgB组、SE-hBCG+CgB组等5组,每组5只;于实验开始第0、2、4周分别给每只小鼠肌内注射SE、SE-hBCG、CgB、SE+CgB、SE-hBCG+CgB各0.2 ml,末次免疫后2周解剖小鼠。实验2:取120只小鼠,分成PBS组、Rab组、SE+Rab组、SE-hBCG+Rab组等4组,每组30只;于实验开始第0周及第1周每只小鼠分别腹腔注射PBS、Rab、SE+Rab、SE-hBCG+Rab各0.2 ml,于初免后第4、8、10、12、14、35天各解剖5只小鼠。无菌摘取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞悬液,采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测抗原特异的IFN-γ或IL-4的斑点形成细胞数(IFN-γ-SFC或IL-4-SFC);取小鼠眼球血,离心后收集血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗原特异的IgG水平。结果SE-hBCG组诱导小鼠产生CgB特异的IFN-γ-SFC(266.0±87.9)高于SE组(104.5±28.8,P<0.05);SE-hBCG+CgB组诱导小鼠产生抗-CgB IgG抗体滴度(18800.0±2396.0)及CgB特异的IFN-γ-SFC(440.5±38.4)高于CgB组(抗体滴度为3333.0±737.9,IFN-γ-SFC为189.2±21.4,P<0.05)。SE+Rab或SE-hBCG+Rab初免后第4天可诱导低水平抗-Rab IgG抗体(OD450≤0.2);Rab、SE+Rab及SE-hBCG+Rab组抗-Rab IgG抗体均于初免后第12天达到峰值;SE-hBCG+Rab组于初免后第8、10、14及35天检测的抗-Rab IgG抗体(分别为1700.0±200.0、19400.0±1661.3、23000±358.9、23600.0±6038.2)均高于Rab组(分别为310.0±97.9、6730.0±1655.4、6000.0±1655.6、4400.0±1655.5,P<0.05)。SE-hBCG+Rab组初免后第4、8、14及35天检测的Rab特异IFN-γ-SFC(分别为110.8±52.5、213.0±29.7、105.2±33.7、80.4±36.8)均高于对照组(分别为6.4±3.5、32.2±12.9、11.4±5.1、4.4±2.5,P<0.05)。结论SE-hBCG可增强CgB及Rab的免疫原性,是一种较好的免疫增强剂。

人巨细胞病毒糖蛋白B基因的分型

目的建立人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B(gB)基因的套式聚合酶链反应(nPCR)加限制性长度多态性分析(RFLP)的分型方法。方法34例HCMV感染患儿的11份全血标本和23份尿标本,用nPCR扩增gB基因片段,RFLP对gB基因进行分型,并通过测序进行验证。结果34例HCMV感染患儿中,检出gBⅠ型13例,gBⅡ型12例,gBⅢ型9例,未发现gBⅣ型。测序结果与基因库中相应的标准株序列进行比较,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的同源性分别为98.1%～99.6%、98.9%～100%、97.3%～98.9%。结论nPCR检测HCMV感染敏感特异,RFLP对HCMV的gB基因分型明确可靠。

巨细胞病毒包膜糖蛋白B的研究进展

人巨细胞病毒是致人类先天畸形的重要病原体之一 ,其包膜糖蛋白B(gB)在病毒感染及诱导机体免疫反应中起重要作用 ,对其结构和功能的深入研究有助于进一步明确HCMV的致病机理 ,为治疗和免疫预防提供新路径。本文对近年来HCMV gB的结构 。

婴幼儿人巨细胞病毒感染的临床表现和糖蛋白B基因分型

目的:了解婴幼儿人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的不同临床表现,以及和不同糖蛋白B(gB)基因型HCMV的关系。方法:ELISA法HCMV-IgM检测确定的HCMV阳性的婴幼儿51例,对其不同临床症状进行分析。其中43例患儿,使用套式PCR(nPCR)法加限制性长度多态性分析(RFLP)进行HCMV gB基因分型。结果:在51例HCMV感染患儿中全身性感染和单脏器感染分别占25.49%和74.51%,HCMV包涵体病和肝炎分别以25.49%和21.57%占较大比例。43例患儿HCMV gB基因的分型结果为,gBⅠ型20例,gBⅡ型9例,gBⅢ型7例,gBⅠ、Ⅱ混合型4例,gBⅠ、Ⅲ混合型2例,gBⅠ、Ⅲ混合型1例,未发现gBⅣ型。gBⅠ型占多数(47.83%)。结论:婴幼儿HCMV感染临床表现种类多样;HCMV感染者以gB I型HCMV占多数。

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的B细胞抗原表位预测

目的:通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒包膜糖蛋白B(gB)的三级结构并预测其线性B细胞抗原表位.方法:根据人巨细胞病毒gB蛋白的胞外域序列,利用DNAStar软件分析其二级结构和表面特性,联合在线B细胞表位预测程序BcePred,通过其理化特性来综合预测该蛋白可能的线性B细胞抗原表位;利用SWISSMODEL服务器的同源建模方法构建gB蛋白的三级结构模型,对在生理三聚体条件下该蛋白各预测表位进行验证.结果:成功预测出人巨细胞病毒gB蛋白的多个线性B细胞抗原表位区段,其中预测出的5个表位区段不属于任何已发现的抗原区域,为后续验证其优势中和表位,研制安全、高效的表位疫苗奠定了理论基础.

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 kD;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。

造血干细胞移植术后人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB抗原血症及gB特异性CD8^+T细胞测定

目的探讨HCMVgB抗原血症在HCMV感染中的诊断价值以及gB诱导的特异性CD8+T细胞在控制病毒激活中的作用。方法根据移植术后时间进行分组,免疫组化法检测92份异基因造血干细胞移植术后白细胞样本中的gB、IE和pp65抗原,分析gB抗原检测在监测HCMV感染中的意义。应用SYFPEITHI和REVEALTM主要组织相容性抗原-肽结合力测定筛选出潜在T细胞表位,进而合成MHC-肽五聚体,应用基于流式细胞术的五聚体染色分析筛选出gB相对优势表位。结果 HCMV gB抗原与pp65和IE抗原检测均呈正相关,其阳性率(82.6%)和pp65抗原阳性率(90.2%)差异无显著意义(P=0.065),但比IE抗原阳性率(92.4%)低(P=0.035)。三种抗原检测阳性率在移植术后1年内无显著差异;而在移植术1年后,gB阳性率低于IE和pp65阳性率(P=0.005),并且在gB阴性而IE或pp65阳性的标本中,IE或pp65阳性值处于一个较低的范围(1~6/5×104WBC)。gB332-340可能是CD8+T细胞的免疫优势靶位,其诱导的gB特异性CD8+T细胞与gB抗原血症的发生呈现负相关。结论 HCMV gB对移植术后早期诊断感染有潜在的价值,并可能是一个提示病毒感染能力的指标;在对长期随访病人HCMV感染的监测中,gB与pp65、IE正相关,或许成为诊断HCMV感染的重要补充;gB特异性CD8+T细胞的免疫应答在控制HCMV感染中可能起到重要作用。

人巨细胞病毒磷蛋白65及糖蛋白B在大肠杆菌中的高效表达、免疫原性研究及初步应用

实验成功的构建了含有pp65与gB主要抗原决定簇基因的表达质粒pET-pp65、pET-gB;表达产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接酶联免疫等一系列鉴定试验进行了分析。表达蛋白经初步纯化后免疫BALB/c小鼠,经0、2、4周免疫三次,免疫后2、4、6周眼眶采血收集抗血清,进行中和试验和ELISA检测。动物试验表明两种表达蛋白具有免疫原性,并可在小鼠体内诱导产生特异性抗体,其中用重组gB蛋白免疫小鼠后得到的抗血清在体外试验中能抑制天然病毒感染细胞。同时将这两种表达蛋白作为诊断用抗原,对临床94份血清进行检测,证实pp65具有较好的特异性,为今后研制HCMV诊断试剂提供了科学依据。

器官移植受者人巨细胞病毒糖蛋白H基因型分析

目的分析器官移植受者人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株糖蛋白H基因型,为进一步研究其致病性、免疫性以及研制HCMV亚单位疫苗提供依据。方法以巢式聚合酶链反应(nested-PCR)检测97例器官移植受者外周血细胞中的巨细胞病毒gH基因并测序分型。结果有23例移植受者的标本经nPCR检出gH基因阳性,阳性率为23.71%,其中骨髓移植受者阳性率10.31%,肝移植受者阳性率5.15%,肾移植受者阳性率8.25%。在23例HCMV分离株中,20例得到gH基因型结果,其中gH1型10例,占50%,gH2型6例,占30%,gH1、2混合型4例,占20%,呈散在分布(χ2=4.00,P>0.05);gH基因型在各移植类型间也呈散在分布(χ2=5.652,P>0.05)。结论HCMV临床分离株糖蛋白基因分别属于gH基因型1～2型,呈散在分布。

人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段的基因克隆和原核表达

目的克隆人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段并构建其原核表达系统。方法用PCR法从人巨细胞病毒AD169株基因组DNA中扩增gB/AD-1片段并克隆至pGEM-T载体,酶切后,亚克隆至表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b/gB/AD-1,并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析一步纯化,并用Westernblot鉴定。结果gB/AD-1蛋白表达量达到35%。表达产物经纯化后,纯度大于95%。经Westernblot检测,表达产物与CMV阳性人血清发生特异性反应。结论已成功构建重组表达载体pET-15b/gB/AD-1,并在大肠杆菌中高水平表达gB/AD-1。

巨细胞病毒磷蛋白糖蛋白研究进展

本文阐述了巨细胞病毒结构蛋白中的磷蛋白、糖蛋白的基因结构和对应的蛋白质多肽及其生物学功能的分子生物学研究进展,明确了以磷蛋白pp150、pp65、pp28和糖蛋白gp58抗原性强,可用于血清学诊断技术的改进;使用糖蛋白和磷蛋白中的某些单一蛋白成分,可增强机体免疫系统抗病毒的能力,并可作为亚单位疫苗,具有广阔的临床应用前景。

巨细胞病毒糖蛋白在骨髓移植术后抗原血症中的临床意义

目的比较人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)糖蛋白B(glycoprotein B,gB)、IE和pp65抗原检测,探讨HCMVgB检测的应用价值。方法检测92份异基因造血干细胞移植术后白细胞样本中的HCMV gB、即刻早期(immediate-early,IE)和磷蛋白65(phosphoprotein 65,pp65)抗原,并按移植术后时间进行分组,分析gB抗原检测在监测HCMV感染中的意义。结果 HCMV gB抗原与pp65和IE抗原检测均呈正相关,其阳性率(82.6%)和pp65抗原阳性率(90.2%)差异无显著意义(P=0.065),但比IE抗原阳性率(92.4%)低(P=0.035)。三种抗原检测阳性率在移植术后1年内无显著差异;而在移植术后时间长于1年的标本中,gB阳性率低于IE和pp65阳性率(P=0.005),并且在gB阴性而IE或pp65阳性的标本中,IE或pp65阳性值处于一个较低的范围(1～6/5×10~4WBC)。结论 HCMV gB对移植术后早期诊断感染有潜在的价值,并可能是一个提示病毒感染能力的指标;在对长期随访病人HCMV感染的监测中,gB可能是较pp65和IE更合适的指标。

人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段在大肠杆菌中高效表达

采用聚合酶链反应,从人巨细胞病毒重组质粒克隆pBH中扩增并分离了含糖蛋白52kD抗原编码区段;扩增产物经纯化和EcoR Ⅰ酶切后,与相同酶切的高效表达质粒pBV-220重组,构成含人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段的高效表达质粒pHcMV 52;用此重组表达质粒转化大肠杆菌JM101,经增殖和42℃温度诱导以及筛选。阳性克隆经12.5％SDS-PAGE表明,外源基因表达蛋白质量占菌体溶解液中蛋白质总量20％。蛋白质印迹(western blot)杂交证实该表达产物具有免疫原性。