人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及活性鉴定

以病毒全基因组为模板,通过PCR技术扩增HCMV pp65基因编码序列,其产物连接到pMD18-T质粒,酶切并回收目的片段后克隆到表达载体pTO-T7,然后将重组质粒pTO-T7-pp65转化大肠杆菌ER2566,大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定,再利用Western blot以及间接ELISA进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定.结果显示:通过SDS-PAGE鉴定可知,大肠杆菌可能表达出了重组蛋白,质谱分析结果说明了重组蛋白为pp65蛋白,具有极高可信度,其相对分子质量约为63 kD,从Western blot和间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)的结果可知,pp65蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性,为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础,同时也为开发HCMV IgG快速诊断ELISA试剂盒提供了可选原料.

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系。方法用重组HCMVpp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL。分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL+金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMVmRNA表达水平的变化。结果pp65-CTL组在HEL细胞感染后72h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL+金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMVmRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药。结论重组HCMVpp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗。

人巨细胞病毒pp65蛋白基因的克隆及表达

目的 构建人巨细胞病毒pp6 5蛋白全长基因的原核表达载体 ,并对表达产物进行纯化。方法 PCR扩增pp6 5的全长基因 ,将其插入到原核表达载体 pRSET ,在工程菌BDPS中进行IPTG诱导表达 ,采用Westenblot进行鉴定并通过亲和层析对表达产物进行纯化。结果 成功构建了全长HCMVpp6 5的原核表达载体并诱导其高效表达 ,用镍离子柱亲和层析获取纯度达 90 %以上的表达蛋白。结论 我们获取的HCMVpp6 5原核表达蛋白纯度较高 ,可将其应用于免疫治疗和临床检测的进一步研究。

人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及免疫学特性分析

目的应用生物工程方法研制人巨细胞病毒包膜蛋白pp65,并行相应抗体制备的探讨性研究。方法利用DNA重组技术,以HCMVAD169病毒株基因组为模板,通过PCR克隆HCMVpp65基因。以pET32a(+)为表达载体,构建重组质粒,并在E.Coli(DE3plys)中诱导表达。然后经柱层析获得纯化蛋白,由蛋白质印迹法验证蛋白的特异性。最后,免疫小鼠获取抗血清,检测抗体产生的效价。结果重组质粒经测序与Genebank序列一致,转染的细菌能高效表达目的蛋白,纯化后的蛋白能与已知单克隆抗体结合,免疫后的小鼠抗血清能同时识别重组蛋白和病毒抗原。结论重组表达的HCMVpp65全蛋白经纯化获得较高纯度,且保留良好的免疫原特性。为HCMV感染诊断用单克隆抗体的研制奠定了基础,并为HCMV感染的免疫诊断和治疗提供了新的研究方向。

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

三株抗人巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的鉴定和应用

目的 制备抗HCMVpp65蛋白的单克隆抗体（简称单抗），并对其进行相关研究。方法 以重组表达的HCMVpp65蛋白为抗原，运用杂交瘤技术制备单抗，对获得的单抗进行Ig亚型、特异性、效价和亲和常数的鉴定与测定，并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较。结果 获得3株针对HCMVpp65蛋白的单抗，即B6、G12、2812；Ig亚型依次为IgG1κ型、IgG1κ型、IgMg型；亲和常数依次为3．6×10^7L／mol、3．8×10^7L／mol、3．1×10^7L／mol；免疫印迹试验结果表明，3株单抗都与HCMVpp65蛋白特异性的结合，除2B12外，B6、G12与EB病毒（EBV）、单纯疱疹病毒（HSV）Ⅰ、HSVⅡ均无交叉反应；与进口单抗平行检测140份临床标本，结果一致（r=1．00，P〉0．05）。结论 成功获得3株稳定分泌抗HCMVpp65蛋白的杂交瘤细胞株，所产生的抗体特异性和亲和力较理想，为HCMVpp65蛋白抗原血症检测国产化试剂盒的研制奠定了基础。

人巨细胞病毒被膜磷蛋白pp65的检测及其在肾移植受者CMV病诊断中的临床应用

目的建立一种简便诊断肾移植受者人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的方法。方法运用催化信号扩增法检测外周血白细胞中的人巨细胞病毒被膜磷蛋白pp65,并与抗HCMV-IgM检测法作比较。结果检测100例肾移植受者中,HCMVpp65抗原阳性47例,IgM抗体检测阳性41例,pp65抗原阳性细胞数为(71±45)个/2×105个WBC,而有症状的CMV病29例,抗原阳性细胞指数为(83±46)个/2×105个WBC。对照组50名健康人,pp65抗原检测全为阴性。pp65的敏感性、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别是100%、74.6%、61.7%和100%。结论该法敏感、简便,可作为肾移植术后HCMV病的早期诊断并可指导抗病毒治疗。

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

建立以重组表达HCMV蛋白为抗原的检测试剂盒，提高试剂盒的敏感性及特异性。从病毒及质粒中分别扩增gp52（281～433aa，f1）及pp65（361～473aa，f2）2个片段，以不同酶切位点同时插入到pTrcHisB载体上，筛选正确的重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。表达蛋白rp52～65占菌体总蛋白的30％，以包涵体的形式存在，分子量为35000.以金属螯合亲和层析（IMAC）及分子筛方法纯化表达蛋白，纯度达到96％，得率为22．9％。以间接法检测HCMVIgM阳性血清，敏感性达到90．4％（19／21）。融合蛋白具有良好的抗原性，可代替gp52及pp65作为HCMVIgM抗体检测试剂盒的包被抗原。

人巨细胞病毒_(gp)52蛋白与_(pp)65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异性,本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白pp65的嵌合抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333,f_1)及pp65(氨基酸261～373,f_2)两个片段,以不同酶切位点插入到pTrcHis B载体上,筛选正确的重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDS-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％,以包涵体的形式存在,分子量为35000。以金属鳌合亲和层析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白,纯度达到96％,回收率为25.2％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清,敏感性达到90.4％(19/21),证明此融合蛋白具有良好的抗原性,可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。

T7噬菌体表达巨细胞病毒PP65蛋白抗原的初步研究

目的利用噬菌体展示技术构建巨细胞病毒基质蛋白PP65的抗原,初步评价其抗原性。方法PP65的基因片段经酶切后,与T7噬菌体的基因组相应酶切位点结合,借助包装蛋白组装成为完整的噬菌体。PP65目的蛋白以融合蛋白的形式表达在T7噬菌体的头蛋白部位,每个噬菌体颗粒表面可表达5～15个拷贝。噬菌体可以在宿主细胞中快速繁殖,并且能够迅速裂解宿主细胞,使目的蛋白的富集达到很高的效率。人巨细胞病毒基质蛋白PP65可以激发机体强烈的免疫反应,运用T7噬菌体载体展示系统表达PP65的部分肽段,扩增噬菌体,以SDS-PAGE电泳和western-blot鉴定所表达的抗原特性。结果获得了重组T7-PP65噬菌体,通过鉴定,噬菌体表达在其头蛋白上的PP65抗原可以被天然PP65的单克隆抗体所识别。结论噬菌体展示技术可以有效地进行病毒蛋白抗原的表达,为抗原筛选和疫苗的研制提供科学依据。将PP65表达在T7噬菌体表面,可以研究其免疫原性及评估其作为疫苗的可能性。

人巨细胞病毒pp150-pp65蛋白的表达与应用

目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价。方法采用PCR方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并与北京英诺特生物技术有限公司合作研制出巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒(胶体金法),与进口试剂盒(酶免法)进行临床标本比对试验。结果成功构建了HCMV的高效表达载体pET28a-pp150-pp65,并得到分子量在45kd的高表达蛋白,具有良好的抗原性。将该蛋白制备成胶体金试剂盒,经600份血清标本的检测,与进口CMV-IgG试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%,总的符合率为90.2%;与进口CMV-IgM试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%,总的符合率为88.5%,稳定性良好。结论高效表达纯化的pp150-pp65重组蛋白抗原性强,利用其建立的胶体金试剂盒与国产已上市试剂盒和进口试剂盒比对,不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且经初步临床应用,表明该试剂盒能检测不同临床感染阶段的患者,具有较好的市场前景。

人巨细胞病毒蛋白pp65在胶质瘤中的表达及意义

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)蛋白pp65在胶质瘤中的表达水平及其意义。方法采用免疫组化方法检测HCMV蛋白pp65在175例人脑胶质瘤组织及10例正常人脑组织中的表达,分析其表达水平与胶质瘤临床病理学特征的关系。结果 pp65蛋白在胶质瘤组织中的表达水平明显高于正常人脑组织(Z=-4.338,P=0.000);pp65蛋白在高恶性度胶质瘤中的免疫染色强度明显强于低恶性度胶质瘤(Z=-0.960,P=0.037),而pp65蛋白免疫染色强度与胶质瘤的病理级别无明显的相关性(r=0.096,P=0.208),以及pp65蛋白免疫染色强度与胶质瘤患者的性别(r=0.138,P=0.069)、年龄(r=0.016,P=0.837)和肿瘤部位(r=-0.147,P=0.052)也均无明显相关性。结论HCMV感染及其蛋白pp65表达可能与人脑胶质瘤的发生存在一定关系,但其确切的致瘤机制尚需进一步研究。

异基因造血干细胞移植后人类巨细胞病毒pp65的监测及疗效、危险因素分析

本研究探讨异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后受者外周血白细胞巨细胞病毒(CMV)pp65抗原阳性细胞数的变化及临床意义。以104例HSCT受者为研究对象,采集移植前后及恢复期受者的抗凝血标本,用CMVpp65单克隆抗体荧光免疫组织化学法检测CMV早期抗原,并进行动态观察。结果表明104例HSCT受者中29例移植后检出CMVpp65抗原阳性,检出率27.88%,其中16例为CMV血症,13例为CMV病。29例经抗病毒治疗后25例抗原转为阴性,有效率86.21%,死亡4例,病死率13.79%。CMV感染患者中,受非血缘或单倍体相合异基因HSCT的患者与受同胞全相合异基因HSCT的患者CMV感染率分别为39.29%和14.58%,两者相比较有显著性差异(P<0.05)。0-Ⅰ度急性GVHD组CMV感染的发生率为19.44%,而Ⅱ-IV度急性GVHD组为46.88%,两者间的差异有显著意义(P<0·05)。CMV抗原阳性与阴性患者的急性GVHD发生率有显著性差异(P<0·05)。结论外周血白细胞CMVpp65病毒抗原检测可作为造血干细胞移植后CMV病的监测指标,用于指导移植后抗病毒的治疗和疗效评价。

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法 以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果 我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论 自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。

应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)-PP65抗原检测的临床意义。方法:利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例(肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例),其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果:56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性(P<0.01)。正常对照组无一例阳性。结论:HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。

人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测方法的建立

目的用制备好的兔和大鼠PP65多克隆抗体建立检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法。方法优化ELISA检测条件,建立检测PP65抗原的标准曲线,确定检测方法的精密度及检出下限。通过对101份临床疑似HCMV感染标本的检测,并与HCMV-IgM(ELISA)以及HCMV-DNA(FQ-PCR)检测结果的比较,分析了该方法的敏感性和特异性。分别检测HSV-1、HSV-2以及EB病毒感染血标本各5份,分析该方法是否非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原。结果以1∶2 000大鼠pAb包被酶标板,以1∶20 000兔pAb为检测一抗,建立了检测PP65抗原血症的ELISA方法。批间精密度与批内精密度均小于10%,检出下限为5 ng/ml。本方法检测的敏感性和特异性与HCMV-DNA(FQ-PCR)无差别(P>0.05),但敏感性高于HCMV-IgM(ELISA)方法(P<0.05)。对HSV-1、HSV-2以及EB病毒感染标本的检测结果均为阴性,排除了该方法非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原的可能。结论建立了检测PP65抗原血症的间接双抗夹心ELISA方法,该方法具有较好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。

人巨细胞病毒pp65基因疫苗的研制

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染的效果。方法应用聚合酶链式反应(PCR)扩增HCMVpp65基因全长、巨细胞病毒(CMV)启动子的上下游序列,转化至质粒并载体,测序;合成分泌肽基因,构建自制的含CMV启动子、pp65基因和分泌肽基因的pcDNA5.0转染载体,即HCMVpp65基因疫苗。将该载体疫苗通过脂质转染法转至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,Western点杂交检测CHO细胞上清中pp65蛋白。结果克隆pp65基因全长测序结果与HCMVAD169株上的pp65标准序列比较:一致性为99.99%。构建了含有分泌肽、CMV启动子(含有增强子和内含子)和pp65全长pcDNA5.0的转染载体,即HCMV基因疫苗。转染至CHO细胞,其上清培养提取物Western点杂交阳性。结论含有分泌肽、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNA5.0真核载体即粗制的HCMV基因疫苗可成功构建。

以重组人巨细胞病毒pp65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法

人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染是造成器官移植失败的重要原因。建立灵敏、特异的检测方法可为及早发现感染、及时给予抗病毒治疗提供依据。以离子交换和分子筛方法纯化重组表达的HCMVpp65(rp65hp)抗原,经两步纯化后,rp65hp纯度达到95%。免疫家兔制备的抗血清,ELISA抗体滴度高达1∶2560000;免疫印迹证明能与HCMVpp65抗原特异反应。将HCMV病毒感染细胞,以纯化的多克隆抗体建立了间接免疫荧光法,成功地检测到细胞中的病毒。因此,该方法为临床检测HCMV病毒活动性感染奠定了良好的基础。

人巨细胞病毒cDNA文库的构建、鉴定及pp65阳性克隆筛选

为进一步进行人巨细胞病毒 (HCMV)后基因组功能的研究 ,以及为疫苗分子和早期诊断试剂的研制提供有效工具 ,从HCMVAD1 69株感染 96h的HF细胞中提取HCMV的mRNA ,逆转录合成cDNA片段 ,重组入λgt1 1EcoRI酶切位点之间 ,包装蛋白包装 ,构建HCMVAD1 69株基因组cDNA表达文库。结果表明 ,初始HCMVcDNA文库容量为 3 6× 1 0 6,重组率为 96% ;HCMV鼠多克隆抗血清筛选出 1 68个HCMV阳性克隆 ;地高辛标记pp65特异性寡核苷酸探针原位噬斑杂交筛选出 3 4个pp65阳性克隆 ,再经PCR扩增 ,筛选出 2个pp65阳性克隆 ;pp65PCR扩增产物进一步被Southernblotting证实 ;3 端测序比较 ,同源性为 98%。为进一步克隆。