胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的观察胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法首先进行人巩膜成纤维细胞原代培养与鉴定,RT-PCR检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA表达,Western blot法检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位蛋白表达,CCK-8检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平的影响。结果成功进行了人巩膜成纤维细胞的原代培养。人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA及蛋白水平的表达。胶原相关整合素α1β11mg·L-1和4mg·L-1抗体组细胞存活率分别为(86.3±4.5)%和(74.3±6.8)%,与对照组的100%相比,细胞存活率均显著下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05),且呈浓度依赖性的抑制作用。胶原相关整合素α2β1抗体在1mg·L-1时有抑制作用,细胞存活率为(89.3±12.1)%,但与对照组的100%相比差异无统计学意义(P>0.05),4mg·L-1抗体组细胞存活率下降为(74.5±6.6)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。胶原相关整合素α1β1(4mg·L-1)抗体组Ⅰ型胶原mRNA表达明显减低,是对照组的0.48倍(P<0.05)。胶原相关整合素α2β1抗体1mg·L-1组和4mg·L-1组Ⅰ型胶原mRNA表达分别是对照组的0.94倍和0.87倍,与对照组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位的表达。胶原相关整合素α1β1和α2β1影响人巩膜成纤维细胞的增殖。胶原相关整合素α1β1参与人巩膜成纤维细胞胶原的合成。

MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2以及Ⅰ型胶原表达的作用研究

目的研究基质金属蛋白酶(MMPs)家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜Ⅰ型胶原表达的作用,探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用。方法应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型,用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞(APMA)及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响;实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1/2以及Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的变化;最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP-2或MMP-1/2后,检测巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白水平的变化。结果 MMPs激动剂引起MMP-1/2活性显著增加,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达下降,MMPs抑制剂引起MMP-1/2活性显著下降,相应的Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01)。激动剂可引起MMP-1mRNA表达增加(P<0.01),对MMP-2mRNA表达无明显影响(P>0.05),而抑制剂能引起MMP-2mRNA表达下降(P<0.01),但对MMP-1mRNA表达无显著影响(P>0.05)。应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后,MMP-1蛋白表达均显著降低(均P<0.01),MMP-2除在MMP-1siRNA干扰敲除组无明显变化外(P>0.05),其余各组均显著下降(均P<0.01);Ⅰ型胶原的表达在各敲除组中显著增加,当MMP-1和MMP-2均干扰敲除时,Ⅰ型胶原的表达增加最为显著(均P<0.01)。结论在人巩膜成纤维细胞系中,MMP-1/2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1/2活性改变及相应的MMP-1/2蛋白表达变化,并最终导致Ⅰ型胶原表达的变化;MMP-1和MMP-2是调控人巩膜Ⅰ型胶原重塑的关键因子。

人巩膜成纤维细胞体外三维胶原基质培养系统的构建及其生物力学特性

背景眼轴的过度伸长和巩膜组织的扩张是高度近视发病机制研究的热点之一，建立合理的人巩膜成纤维细胞（HSFs）培养体系模型有助于进一步探讨HSFs在高度近视形成过程中与胶原基质相互作用的生物学机制。 目的构建HSFs与Ⅰ型胶原的三维培养系统，微观模拟在体巩膜，建立巩膜重塑模型。 方法采集新鲜供体巩膜组织，采用组织块培养法分离和培养HSFs，采用免疫荧光技术检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定细胞；获取8周龄SPF级雄性SD大鼠鼠尾腱制备鼠尾胶原，400 μl胶原加入50 μl NaOH（0.1 mol/L）溶液中混匀，加入80 μl 10倍培养液，混匀，溶液pH值约为7。加入1 100 μl终浓度1×106/ml细胞悬液混合形成凝胶培养系统，于倒置相差显微镜下观察HSFs的增生情况和细胞形态，采用IPP-5软件对三维培养的含细胞胶原收缩面积进行测量以分析三维胶原系统的物理特性；采用生物力学试验机对三维胶原系统的生物力学特性进行测定。 结果培养的HSFs波形蛋白呈阳性表达，角蛋白表达阴性。未接种培养细胞的无成纤维细胞SD鼠鼠尾胶原凝胶透明，实验期间性状无明显变化，而含HSFs的三维胶原凝胶随着细胞培养时间的延长细胞数量增加，倒置相差显微镜下可观察到数十层成纤维细胞相互交错呈网状排列，培养后7～14 d凝胶块呈乳白色，凝胶面积保持在正常的10%左右，三维培养系统中的HSFs接种后24 h细胞产生多向性突起，呈双极形或纺锤形。HSFs胶原凝胶复合物的弹性材料蠕变曲线呈非线性（0～100 s）部分与线性（100～600 s）部分，前者是胶原凝胶在短暂应力的作用下本身的弹性变化，后者是胶原凝胶在定力的作用下随拉伸时间的延长而出现的蠕变变化。 结论鼠胶原凝胶对培养的HSFs有良好的生物相容性，HSFs胶原凝胶可形成三维复合物，可呈现机械性生物学特性，是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型，可用于巩膜重塑的模拟研究。

人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与近视发生、发展的关系及其对PI3K-Akt信号通路的调控作用

目的探讨人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与近视发生、发展的关系及其对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路的调控作用。方法利用形觉剥夺法建立豚鼠左眼(实验眼)近视模型,右眼为对照眼,采用实时定量PCR法检测豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184以及PI3K-Akt信号通路相关mRNA的表达水平,采用Pearson相关分析豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)mRNA表达水平的相关性。体外培养人巩膜成纤维细胞,并分为对照组(mimics对照组)、高表达组(转染miR-184 mimic)、低表达组(转染anti-miR-184)和PI-103组(加入PI3K通路抑制剂PI-103)。采用Western blot检测各组人巩膜成纤维细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平,流式细胞检测技术检测细胞增殖,Annexin V-FITC染色观察细胞凋亡。结果豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均明显低于对照眼(均为P<0.05),且实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均呈正相关性(均为P<0.05)。体外实验中,培养24 h、48 h、72 h、96 h时,高表达组人巩膜成纤维细胞增殖倍数>对照组>低表达组>PI-103组;培养24 h时,4组人巩膜成纤维细胞增殖倍数比较差异无统计学意义(P>0.05);培养48 h、72 h、96 h时,4组人巩膜成纤维细胞增殖倍数整体比较以及组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。培养24 h时,4组人巩膜成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),PI-103组>低表达组>对照组>高表达组,组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。培养72 h时,4组人巩膜成纤维细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平差异均有统计学意义(均为P<0.05),高表达组人巩膜成纤维细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平>对照组>低表达组>PI-103组,组间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论近视眼的发生、发展与巩膜组织中miR-184表达下调有关,其作用机制可能为miR-184表达下调导致PI3K-Akt信号通路调控受阻,进而抑制巩膜成纤维细胞增殖以及促进细胞凋亡。