人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。

人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达

目的:建立新的检测方法,克隆并表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(W estern b lot)试验。结果:PCR产物约为1 200 bp,与预期1 224 bp接近,测序结果与Gen-Bank报道的完全一致。pGEX-5T-SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和W estern b lot结果显示融合蛋白相对分子质量为71 000,具有天然SS-B的免疫原性。结论:成功克隆表达SS-B,为下一步研究奠定了基础。

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:PCR扩增SS-B基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SS-B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果:PCR产物约为1200 bp,与预期1224 bp接近,pPIC9k-SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的分子量约48 000,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60%以上,产物浓度为800- 900mg/L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS-B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论:SS-B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。