人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

人干细胞生长因子(humanstemcellgrowthfactor,hSCGF)是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式,包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域(calcium-dependentcarbohydraterecognitiondomain,CRD)内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。为克服hSCGF的cDNAGC含量较高的困难,本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库(Clontech)中成功克隆hSCGFcDNA,进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中,融合表达。研究结果表明,通过低温诱导(28℃),重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中,利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明,不同于截短型分子hSCGFβ,全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。结论:hSCGFCRD不直接结合受体,可能具有其他生物学功能。

检测重组人干细胞生长因子生物活性方法的改进

目的 比较检测重组人干细胞生长因子生物学活性的方法。方法 应用Mo7e细胞系MTT(四甲基偶氮唑盐 )比色、3H TdR掺入方法和CFU GM半固体检测技术 ,检测rhSCF和rhGM CSF生物学活性。结果 Mo7e细胞系MTT比色方法检测重组人SCF生物学活性与半固体集落培养技术以及3H TdR掺入具有同样的灵敏度。结论 该方法为研究SCF作用于造血干细胞的机理、信号传导以及临床前期的研究 。

重组人干细胞生长因子(rhSCF)生物活性测定方法研究

目的 建立rhSCF生物活性测定方法。方法 分别采用MTT比色法与琼脂集落培养法进行rhSCF生物活性测定。结果 两种方法对同批次rhSCF成品测定结果无显著性差异。结论由于MTT比色法操作简便、稳定性好,可以替代琼脂集落培养法,使rhSCF测定更加准确、可行。

微小RNA-29a在膝骨关节炎兔子中的表达及其对干细胞生长因子β、血管内皮生长因子表达和炎症反应的影响

目的探讨微小RNA(miRNA)-29a在膝骨关节炎(KOA)兔子中的表达水平及其对干细胞生长因子β(SCGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)表达水平及炎症反应的影响。方法(1)在48只新西兰兔中取8只作为空白对照组,另外40只用于建立KOA模型,建模成功后随机平均分为非干预组、SCGF-β组、VEGF组和SCGF-β+VEGF组。SCGF-β组、VEGF组和SCGF-β+VEGF组分别采用相应抗体干预,空白对照组与非干预组采用等量生理盐水干预。干预1周后,检测各组血清miRNA-29a、SCGF-β、VEGF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和C反应蛋白(CRP)的表达水平。(2)取非干预组兔子的软骨组织制备KOA软骨细胞,利用miRNA-29a模拟物(Mimic组)、miRNA-29a阴性对照物(NC组)和miRNA-29a抑制物(Inhibitor组)转染细胞。正常组不予干预。7 d后检测各组软骨细胞miRNA-29a的表达水平及SCGF-β、VEGF mRNA和蛋白的相对表达水平。结果(1)与空白对照组相比,非干预组、SCGF-β组、VEGF组及SCGF-β+VEGF组的血清miRNA-29a表达水平均降低,而血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP水平均升高(均P<0.05)。SCGF-β组和SCGF-β+VEGF组的血清SCGF-β表达水平均低于VEGF组与非干预组,VEGF组和SCGF-β+VEGF组的血清VEGF表达水平均低于SCGF-β组与非干预组;SCGF-β组、VEGF组和SCGF-β+VEGF组的血清TNF-α和CRP表达水平均低于非干预组,且SCGF-β+VEGF组的血清TNF-α和CRP表达水平均低于SCGF-β组与VEGF组(均P<0.05)。(2)正常组及NC组miRNA-29a相对表达水平低于Mimic组,高于Inhibitor组;且Inhibitor组miRNA-29a相对表达水平低于Mimic组(均P<0.05);3组转染后的软骨细胞SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相对表达水平均为Inhibitor组>NC组>Mimic组(均P<0.05)。结论KOA兔子血清miRNA-29a的表达水平降低,血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表达水平升高,下调SCGF-β和VEGF表达可抑制KOA兔子体内的炎症反应。上调miRNA-29a表达水平可抑制KOA软骨细胞SCGF-β、VEGF的表达,这有助于减轻KOA引起的炎症反应,从而控制病情。

hSCGF-α穿膜肽的构建及其对hUCMSCs增殖作用的影响

目的:构建hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF),研究其对人脐带间充质干细胞的增殖作用。方法:采用基因工程技术将hSCGF-α基因重组插入pET-28a(+)质粒DNA,构建TAT-SCGF-28a重组DNA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效表达,包涵体纯化后,通过实验比较hSCGF-α及hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF)对人脐带间充质干细胞的增殖刺激作用。结果与结论:成功构建TAT-SCGF-28a重组DNA;纯化的蛋白纯度达90%以上;TAT-SCGF较不具有穿膜功能的SCGF对人脐带间充质干细胞有更强的增殖效果。