阿糖胞苷作用下白血病细胞膜人核苷转运体1基因表达变化研究

目的检测肿瘤细胞膜上人平衡型核苷转运体1(human equilibrative nucleoside trans-porter 1,hENT1)基因表达及其变化,探索影响阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性白血病(AL)疗效的相关因素。方法根据目前临床采用的低剂量、中剂量和大剂量Ara-C(HD-AraC)治疗时所能达到的血浆药物浓度,分别采用0.5～100μmol/L中的6种不同剂量(0.5、1.0、5.0、15、50、100μmol/L)体外作用于白血病细胞株Jurkat和NB4,经4～48 h的5个时间段(4、8、12、24、48 h)作用后,采用定量RT-PCR方法测定hENT1 mRNA表达及其变化。结果 (1)Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA原始相对表达量(ΔCt值)分别为5.21±0.02和5.34±0.05,两者差异无显著性(P>0.05)。(2)在较低剂量Ara-C(0.5～15μmol/L)作用下,hENT1 mRNA表达恒定,与阴性对照组差异无显著性(P>0.05);但在高浓度Ara-C(50μmol/L和100μmol/L)作用48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1 mRNA表达明显增强,ΔCt分别为2.02±0.17和2.19±0.02,与对照组(5.21±0.02)比较差异均有显著性(P<0.05)。(3)同一种细胞在50μmol/L和100μmol/L两个剂量组的hENT1mRNA表达增高程度,差异无显著性(P>0.05);分别来源于ALL和AML的Jurkat和NB4细胞的表达量间差异亦无显著性(P>0.05)。结论 HD-AraC处理48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA表达可明显提高,有利于药物进入细胞,以增强抗白血病效应,推测临床HD-AraC疗法采用48～72 h的疗程是必要的。

晚期非小细胞肺癌患者手术标本人源核苷酸平衡转运体1蛋白表达与吉西他滨化疗敏感度的相关性分析

目的 评价非细小细胞肺癌（NSCLC）患者术后人源核苷酸平衡转运体1（hENT1）蛋白表达水平与吉西他滨化疗敏感度的相关性。方法筛选2007—2011年浙江金华广福医院肿瘤内科收治的经病理确诊为NSCLC并行手术切除后患者47例，完全随机分为GP组和NP组，GP组23例选用吉西他滨联合顺铂化疗，顺铂80 mg/m^2，第 1-3 天静脉滴注，吉西他滨 800-1 250 mg/m^2，第1、8天使用；NP组24例选用长春瑞滨联合顺铂化疗，顺铂用法同前，长春瑞滨 25 mg/m^2，第1、8天使用。对47例患者手术切除肺癌组织蜡块标本采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连结法检测hENT1蛋白表达水平。术后实施2周期以上吉西他滨或长春瑞滨化疗，随访患者的生存期，评价hENT1蛋白表达水平与2种化疗方案疗效相关性。结果GP组hENT1高表达患者13例，无进展生存期为（28±18）个月，中位无进展生存期32个月；NP组hENT1高表达患者14例，无进展生存期为（24±16）个月，中位无进展生存期22个月，差异均有统计学意义（P=0.042，P=0.037）。GP组hENT1低表达患者（10例）中位总生存期35个月,NP组hENT1低表达患者（10例）中位总生存期34个月比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论对于NSCLC患者， hENT1蛋白表达程度与吉西他滨的化疗敏感性相关。

人类平衡型核苷转运蛋白1高表达晚期非小细胞肺癌患者术后应用不同剂量吉西他滨治疗的临床效果观察

目的 观察晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中人类平衡型核苷转运蛋白1（hENT1）高表达患者应用不同剂量吉西他滨治疗的临床效果.方法 选取2008年7月至2013年12月于浙江金华广福医院行晚期NSCLC手术后,病理确诊晚期NSCLC患者,采用免疫组织化学SP法检测肺癌组织中hENT1抗体的表达水平.62例hENT1高表达患者入组,按随机数字表分组法分为对照组（30例）和观察组（32例）.对照组采用常规剂量吉西他滨（1 000 mg/m2）联合顺铂进行化疗,观察组用低剂量吉西他滨（250 mg/m2）联合顺铂进行化疗,观察2组近期疗效、化疗不良反应.采用生活质量调查核心量表QLQ-C30和肺癌专用量表QLQ-LCl3比较2组化疗后生活质量.结果 对照组和观察组近期有效率和疾病控制率差异无统计学意义[43.3％ （13/30）比46.9％ （15/32）,76.9％ （23/30）比81.2％（26/32）]（x2 =0.08,x2 =0.20,P＞0.05）.观察组Ⅲ、Ⅳ度白细胞减少、血小板减少及恶心、呕吐发生率低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;除角色功能外,观察组化疗后总体生活评分及躯体功能、情绪功能、认知功能、社会功能、经济状况各项评分均优于对照组[（54±20）分比（54±16）分,（72±25）分比（62 ±20）分、（85 ±20）比（72±19）分、（76±28）分比（62±25）分、（61 ±24）分比（49 ±30）分、（36±24）分比（56±21）分],差异均有统计学意义（均P＜0.05）.观察组除乏力症状外其他症状评分均优于对照组（P＜0.05）.结论 对于晚期NSCLC术后hENT1高表达患者,在保证化疗效果的同时,相对于常规剂量吉西他滨,低剂量用药可有效降低化疗过程中不良反应,提高患者的生活质量.

细胞外腺苷介导核苷转运体ENT1阻断cAMP/p-PKA信号通路抑制肝脏糖异生

糖尿病的关键特征是葡萄糖和脂质代谢紊乱。目前,糖尿病已成为沉重的全球疾病负担。越来越多的证据表明,腺苷系统在调节胰岛素和葡萄糖平衡中发挥关键作用。腺苷是一种重要的细胞代谢调节剂,通过激活G蛋白偶联受体和核苷转运体参与能量代谢、免疫调节、氧化应激等多个生理病理过程。然而,腺苷在肝脏糖异生调控中的角色尚未被阐明。该文从多层面验证了腺苷通过核苷转运体(equilibrative nucleoside transporter,ENT)转运入胞内后对胰高血糖素刺激引起的肝脏糖异生通路的影响。结果显示,在体内模型中,外源性腺苷显著抑制小鼠血糖升高。在细胞模型中,腺苷以剂量依赖的方式抑制肝脏糖异生进而降低葡萄糖输出水平,且无细胞毒性。肝脏组织及细胞中ENT广泛表达,其中1型核苷转运体(equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1)介导了腺苷抑制的肝糖输出。此外,腺苷介导的糖异生抑制并非依赖于AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]通路的激活。最后发现,细胞外腺苷刺激后,细胞内的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)浓度显著降低,磷酸化蛋白激酶A(phospho-protein kinase A,p-PKA)下游蛋白表达受抑制,细胞糖输出能力显著下降,该抑制作用可被ENT抑制剂有效逆转,但不能被AK抑制剂削弱。以上结果表明,细胞外腺苷通过ENT1转移入胞内后,抑制AC活性,从而抑制cAMP合成和p-PKA底物蛋白的表达,抑制肝脏糖异生功能,最终降低糖输出水平。

中国汉族人群PGC-1α基因Thr394Thr和Gly482Ser变异在2型糖尿病家系中传递的不平衡分析

目的了解中国汉族人群PGC-1α基因Thr394Thr和Gly482Ser变异与2型糖尿病的相关关系。方法招募350名中国南方汉族2型糖尿病先证者及其一级亲属，抽提外周血DNA。应用聚合酶链反应邛艮制性片段长度多态性（PCR—RFLP）分析和DNA直接测序技术鉴定PGC-1α基因型。基于2型糖尿病家系，采用单倍型相对危险度分析（HRR）和传递不平衡检验（TDT）方法分析Thr394Thr和Gly482Ser变异及其单倍型与2型糖尿病的关系。结果基于2型糖尿病家系的HRR分析显示，PGC-1α基因482Ser（A）等位基因更多向子代传递（x2=7．2170，P=0．0072，HRR=1．4496），而Thr394Thr（G／A）等位基因在传递与未传递两组间分布频率差异无统计学意义（x2=2．9557，P=0．0856，HRR=0．7638）。TDT分析提示，394Thr（A）-482Ser（A）单倍型在两组问分布差异有统计学意义（x2=33．160，P=0．002），且与2型糖尿病呈连锁不平衡关系（X2=4．6841，P=0．0292）。结论394A--482A联合变异可能增加了中国人患糖尿病的风险。

五羟色胺转运体及神经肽S受体基因多态性与原发性失眠的致病机制研究

目的研究五羟色胺转运体(5-HTT)基因和神经肽S受体(NPSR)基因的多态性、连锁不平衡及单倍型与原发性失眠(PI)发生的相关性。方法利用生物信息学方法和国际HapMap计划以及NCBI公布的人群中的单核苷酸多态性(SNP)数据,构建出单体型域,并结合功能提示,共挑选5个5-HTT及13个NPSR等位基因频率>5%的单体型标签SNP位点。共收集157例原发性失眠症患者和133例年龄、性别相匹配的正常对照组,抽取静脉血分离后对5个5-HTT及13个NPSR标签SNP位点进行测序,利用SHEsis在线软件对所选SNP位点基因型及等位基因进行连锁不平衡和单倍型分析,得出结果。结果所有SNP位点基因型在对照组中符合Hardy-Weinberg平衡检测(P>0.05)。失眠组与对照组的年龄、性别差异无统计学意义(均P>0.05)。NPSR的SNP位点rs323920的T/C型与健康对照组比较差异有统计学意义(P=0.042),NPSR的SNP位点rs324957的A/G型与健康对照组比较差异有统计学意义(P=0.023)。连锁不平衡分析结果显示,5-HTT-SNP位点rs140700与rs6352之间存在完全连锁不平衡,13个NPSR SNP位点两两间进行连锁不平衡分析,发现多个位点之间存在完全连锁不平衡。单倍型结果分析示,5-HTT-SNP位点CGTT单倍型在PI组和对照组中的差异有统计学意义(P<0.05)。NPSR-SNP位点CACGGTCCCCAGC单倍型在PI组和对照组中的差异有统计意义(P<0.01)。结论神经肽S基因多态性rs323920位点和rs324957位点可能是原发性失眠的易感基因位点,NPSR的SNP单体型rs323920的基因型T>C变异和rs324957基因型的A>G变异可能是原发性失眠的易感基因,5-HTT和NPSR SNP位点的连锁不平衡与原发性失眠相关,NPSR-SNP位点CACGGTCCCCAGC单倍型组合为原发性失眠人群的危险基因,原发性失眠发生率显著升高。5-HTT和NPSR基因在原发性失眠的遗传病因中可能起着一定作用。

人平衡核苷转运体1与胰腺癌化疗耐药性的关系

吉西他滨是临床胰腺癌化疗首选药物之一，然而患者对吉西他滨的化疗敏感性并不相同，部分患者对吉西他滨原发或继发耐药。人平衡核苷转运体1是介导吉西他滨进入肿瘤细胞的主要转运体，人平衡核苷转运体1在在不同患者肿瘤细胞中的表达差异性是造成胰腺癌吉西他滨化疗耐药的原因之一。

江苏地区汉族儿童多药耐药基因3个单核苷酸多态性位点的单倍型研究

目的分析江苏汉族人群多药耐药基因-1(MDR1)的单核甘酸多态(12外显子1236C→T突变、21外显子2677G→T/A突变、26外显子3435C→T突变)及其构成的单倍型分布。方法通过多重单碱基延伸反应(SNaPshotSNP分型技术)对江苏地区170名健康儿童的MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T的SNP位点进行基因分型,统计各基因型频率。UNPHASED软件对MDR1的SNPs(C1236T-G2677T/A-C3435T)进行单倍型分析。结果在170例儿童中,等位基因1236T、2677T、2677A、3435T频率分别为63.5%、37.4%、17.0%和35.0%。基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(HWE),差异无统计学意义(P>0.05)。MDR1的1236、2677、3435三个位点间(C1236T-G2677T/A-C3435T)存在连锁不平衡性,以TTT(31.8%)、TGC(25.3%)、CGC(17.7%)和CAC(16.2%)四种单倍型为主。结论江苏地区汉族人群MDR1的单核甘酸多态及单倍型分布具有自己的特点。在临床应用相关药物时,进行基因型及单倍型检测,将有助于指导临床个体化用药。

英国史宾格犬酪氨酸关联蛋白1(TYRP1)基因多态性及单倍型研究

探讨英国史宾格犬毛色与酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）基因的相关性。本研究采用DNA测序技术、AS-PCR以及PCR-RFLP对英国史宾格犬群体的TYPR1基因编码区进行多态性检测和基因分型,分析多态位点间的关系。结果表明：TYRP1基因编码区存在3个多态位点,T121A和P345△2个多态位点基因型频率分布符合H-W平衡,C991T位点基因型频率分布不符合H-W平衡。经χ~2独立性检验,T121A和P345△多态位点与犬2种毛色极显著相关（P〈0.01）;C991T位点与犬2种毛色显著相关（P〈0.05）。3个多态位点两两间连锁不平衡分析发现连锁不平衡系数｜D′｜值都为1。3个多态位点构成3种单倍型：AC△、TTP和TCP;得到6种单倍型组合,每一种单倍型组合决定犬特定的毛色类型。因此,本研究成功建立了犬毛色基因TYRP1编码区多态位点的检测方法,为进一步研究毛色基因型与犬的胆量大小的相关性提供了前期工作基础。

hENT1单核苷酸多态性与接受含吉西他滨方案非小细胞肺癌患者疗效的关系

目的探讨晚期非小细胞肺癌患者接受含吉西他滨方案的疗效与人类核苷酸平衡转运体(h ENT)1基因-706位点单核苷酸多态性间的关系。方法 225例经吉西他滨+顺铂或卡铂(GP)方案化疗的晚期非小细胞肺癌(ⅢA+ⅢB或者Ⅳ期)病例,化疗前取外周静脉血2 ml,提取外周血DNA,聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因,DNA测序技术检测h ENT1G-706C(rs61758845)的基因型。结果 h ENT1G-706C不同的基因型对化疗效果有显著区别,GC+CC型基因型的患者化疗收益率明显低于GG型(OR=2. 34,95%CI:1. 14～4. 80;P=0. 02)。GG型和GC+CC型患者总生存期差异有显著性(19. 0 vs 15. 0个月,P<0. 001)。结论 h ENT1基因G-706C位点的单核苷酸多态性与接受吉西他滨为基础的联合化疗的晚期非小细胞肺癌患者疗效有关,它有可能成为将来指导非小细胞肺癌患者治疗的一个生物标志物。

人平衡核苷转运体1在肿瘤性疾病中的研究进展

人平衡核苷转运体1(human equilibrative nucleoside transporter 1,hENT1)是介导核苷、核碱基和核苷类化疗药转运的多元整合膜蛋白,在人体内主要分布在细胞膜上。hENT1通过易化扩散维持细胞内核苷稳态及核苷类化疗药物在细胞内的浓度,从而影响DNA和RNA合成、细胞信号传导、代谢调节及肿瘤的化疗效果。该文就hENT1结构与功能、在肿瘤组织分布、与核苷类化疗药敏感性及肿瘤预后的关系方面作一综述。

中国人群白介素1受体相关激酶4基因多态性与脓毒症易感性的相关性研究

目的探讨白介素1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)多态性位点与脓毒症发生风险及疾病严重程度的关联性。方法采用Hapmap单倍型标签SNPs(htSNPs)策略和SNPstream分型方法,对255例脓毒症患者和260例对照个体进行分型。采用Logistic回归分析,校正性别、年龄、吸烟和饮酒、慢性病状态、A-PACHEⅡ评分和脓毒症病因等混杂因素的影响,评价IRAK4多态性位点与脓毒症的发生风险,以及脓毒症性休克、死亡和多器官功能障碍的遗传相关性。结果 IRAK4基因在中国人群中共捕获6个htSNPs。rs4251431 G/T,rs4251460A/C,rs4251513 G/C和rs4251545 G/A最终用于分型研究。4个htSNPs位点在病例和对照组中的基因型分布均呈Hardy-Weinberg平衡状态。IRAK4多态性位点及单倍体与脓毒症的发生风险和疾病严重程度均无明显相关性。结论在中国人群中,IRAK4基因多态性位点在脓毒症的发生、发展和病程转归中可能不发挥重要作用。

ENT1在人肝癌细胞中的表达特征及临床意义

目的:探讨ENT1在人肝癌细胞株中的表达特征及其临床意义.方法:人肝癌细胞HuH-7、HepG2、Hep3B并选择人乳腺癌细胞MCF-7为对照,采用免疫荧光法检测细胞中ENT1的定位表达;RT-PCR法检测细胞中ENT1mRNA的表达;CDKs特异性抑制剂干预人肝癌细胞HuH-7的细胞周期,RT-PCR法检测细胞不同周期ENT1mRNA的表达特征.结果:3株人肝癌细胞膜上均可见ENT1的表达;肝癌细胞中ENT1mRNA的表达水平均高于乳腺癌细胞;不同肝癌细胞株中ENT1mRNA的表达水平存在差异(HuH-7:0.756±0.019,HepG2:0.469±0.041,Hep3B:0.580±0.030,MCF-7:0.356±0.029);肝癌细胞被阻滞在G0/G1期后,ENT1mRNA的表达水平明显上调(0.737±0.017vs0.345±0.027,P<0.05).结论:人肝癌细胞膜上普遍存在较高的ENT1表达,不同的肝癌细胞及不同的细胞周期其表达均存在差异.ENT1在人肝癌细胞中的表达特征对临床化疗策略具有潜在的临床价值,并为认识肝癌的耐药机制提供新的思路.

hENT1蛋白和RRM1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨人类平衡型核苷转运载体1(hENT1)及核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)在非小细胞肺癌(NSCLC)发病、预后中的作用及机制。方法应用免疫组化方法检测54份NSCLC组织及癌旁正常组织中hENT1、RRM1蛋白表达情况,并分析其与NSCLC临床病理特征及接受含吉西他滨方案化疗患者生存时间的相关性。结果hENT1蛋白及RRM1蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率均显著高于癌旁正常肺组织(P<0.05),但均与年龄、性别、生存时间等临床特征无显著相关性;hENT1蛋白阳性表达、RRM1蛋白阴性表达者生存时间显著高于RRM1蛋白表达阴性、hENT1蛋白表达阳性者(P<0.05)。结论hENT1蛋白和RRM1蛋白在NSCLC发病中具有一定作用,二者可通过调节化疗药物敏感性影响患者预后;联合检测上述两种蛋白表达有利于为患者制订个体化治疗方案。

RRMl、hENT1的表达与胰腺癌吉西他滨化疗疗效相关性研究进展

胰腺癌预后较差,化疗在胰腺癌的治疗中发挥重要作用。以吉西他滨的主的化疗方案是胰腺癌化疗的标准方案。而吉西他滨耐药仍然是延长患者总生存(overall survival,OS)和无病生存期(disease free survival,DFS)的重要阻碍。目前研究表明,在多种吉西他滨耐药细胞系中RRM1和h ENT1有不同程度表达。而目前通过对RRM1、h ENT1等相关基因的表达预测吉西他滨的化疗效果的研究仍处于初级阶段,有待更进一步的研究。本文对RRM1、h ENT1的表达与吉西他滨化疗的耐药性及预后新进展作一综述。

hENT-1表达水平对胰腺癌吉西他滨辅助化疗的影响

目的:本研究探讨胰腺癌hENT-1表达水平对吉西他滨辅助化疗的影响。方法:利用胰腺癌组织切片,行hENT-1免疫组织化学实验,针对其染色强度、范围计算评分。追踪回访对应患者的预后情况后行统计学分析。结果:hENT-1高表达组与低表达组的OS为20个月对10个月,DFS为15个月对6个月。OS的独立预后因素是hENT-1表达水平、淋巴转移情况和病理分级。DFS的独立预后因素是hENT-1表达水平和病理分级。病人之间临床资料与hENT-1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:胰腺癌细胞中hENT-1的表达水平可能影响吉西他滨辅助化疗敏感性,hENT-1高表达者使用吉西他滨辅助化疗后的OS及DFS较低表达者长。

Mdivi-1对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元保护作用及其机制研究

目的研究线粒体分裂蛋白抑制剂(Mdivi-1)对癫痫大鼠行为学及海马区线粒体动力相关蛋白1(DRP1)、平衡型核苷转运载体1(ENT1)蛋白的影响。方法20只雄性SD大鼠随机均分为正常组、模型组、DMSO组、Mdivi-1组。观察各组大鼠行为学改变,透射电镜观察脑组织结构变化;免疫组化及免疫荧光法检测各组大鼠海马区DRP1表达;Western blot检测各组大鼠海马区DRP1、ENT1蛋白变化。结果与模型组或DMSO组相比,Mdivi-1组大鼠癫痫发作潜伏期明显增加而发作频率下降(P<0.05);电镜观察结果显示,模型组部分内外膜崩解,线粒体明显破坏、肿胀而Mdivi-1组损伤情况减轻;免疫组化结果显示,模型组大鼠脑组织海马区DRP1阳性细胞数增多,而Mdivi-1组阳性细胞数下降(P<0.05);免疫荧光显示,DRP1在海马神经元中有表达;Western blot结果显示,与正常组相比,DMSO和模型组中ENT1、DRP1蛋白表达升高,而Mdivi-1组中ENT1、DRP1蛋白表达下降(P<0.05)。结论Mdivi-1能靶向阻断DRP1,调控线粒体动力学平衡,从而影响ENT1表达,对海马神经元具有神经保护的作用。

重庆人群IL-1β启动子区-31、-511、-1470单核苷酸多态性位点间的连锁不平衡分析

目的 调查IL 1β启动子区 -3 1、-5 11、-14 70 3个单核苷酸多态性 (singlenucleotidepoly morphisms ,SNPs)的发生频率及是否存在连锁不平衡 (linkagedisequilibrium ,LD )关系。 方法 采用限制性片段长度多态性方法对重庆地区 112名健康个体IL 1β -3 1、-5 11、-14 70SNPs位点进行基因分型 ,应用软件TransposerV1 0对 3个SNPs位点进行LD分析及Pearsonχ2 检验 ,应用软件Arlequine计算单倍型频率及单倍型组成。结果 10 7名重庆地区正常个体IL 1βC -3 1T、T -5 11C、G -14 70C 3个SNPs的发生频率分别是 45 .3 3 %、5 0 0 0 %及 41.67%。IL 1β启动子区 3个SNPs主要组成 3种单倍型 :T C G( 4 4 1% )、C T C( 4 0 3 % )和C T G( 8 8% )。通过对这 3个SNPs位点两两间进行LD分析 ,发现所有的LD参数 (Δ值 )都不为 0 ( χ2 检验 ,P <0 .0 0 5 )。结论 重庆地区人群IL 1β启动子区 -3 1、-5 11、-14 70 3个SNPs位点呈紧密的连锁不平衡。本研究结果为寻找与炎症等疾病相关单倍型奠定了基础。