人心肌肌钙蛋白I的纯化及鉴定

目的 提取和纯化人心肌肌钙蛋白I。方法 心室肌经匀浆、离心、盐析提取 ,CMSephadexC 5 0柱层析 ,DEAESephadexA 5 0柱层析制备人cTnI ;经 (cTnI)活性检测、SDS PAGE、westernblot鉴定。结果 从 6 5 g湿重心肌中获得 4 .1mgcTnI ,分子量约为 2 4 0 0 0 ,纯度约为 84 %。结论 纯化的cTnI可被cTnI单克隆抗体特异识别 ,本实验从人心肌中成功制备cTnI。

人心肌肌钙蛋白I的原核表达与纯化

目的构建人心肌肌钙蛋白I(human cardiac troponin I,hcTnI)原核表达载体并表达、分离纯化重组蛋白。方法RT-PCR从人心肌组织中克隆出hcTnI的cDNA序列构建到原核表达载体pQE30,获得重组表达质粒pQE30-hcTnI,并在大肠杆菌M15中诱导表达。镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,Western Blot杂交鉴定重组蛋白。结果经测序证实,获得的目的基因与(GeneBank M64247)公布的hcTnI基因序列一致。pQE30-hcTnI在大肠杆菌M15中经IPTG诱导后表达出相对分子量约为29 kD的目的蛋白,镍柱纯化后经抗hcTnI单克隆抗体进行Western印记,在相对分子量约29kD处可见特异性着色带。结论体外成功诱导了重组hcTnI蛋白表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的hcTnI蛋白,为进一步获得hcTnI的抗体及建立相应的临床快速检测方法奠定了实验基础。

重组人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组人心肌肌钙蛋白I(rhcTnI)的单克隆抗体,并对其单克隆抗体的特性进行鉴定。方法利用纯化后的rhcTnI作为免疫原,常规免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与同系骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,用甲基纤维素半固体培养基法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株,利用ELISA、Western blot等方法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果筛选出3株稳定分泌抗rhcTnI的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4B3、7D5和3E6。3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1(4B3、7D5)和IgG2b(3E6)。3株单克隆抗体与rhcTnI发生特异性结合,而与大肠杆菌菌体蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)无特异性交叉反应,3株单克隆抗体的亲和力常数分别为1.76×109L/mol、1.43×109L/mol和1.04×109L/mol。结论获得了效价高、特异性好的抗rhcTnI的单克隆抗体,为cTnI诊断试剂盒的研制奠定了基础。

血清人心肌肌钙蛋白I快速测定方法的建立

目的 :建立一种简便、快速、准确检测人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的胶体金免疫层析法。方法 :应用cTnI免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 /0骨髓瘤细胞进行细胞融合筛选 ,获得分泌高效价抗cTnI抗体细胞株 6株。其中 3F10作为金标抗体 ,3A7作为生物素化抗体 ,链霉亲合素结合于硝酸纤维素膜 ,制成免疫层析测试条 ,依据测试条上出现肉眼可见的红色线条判定结果。结果 :检测灵敏度可达 0 4ng/ml。测定 30例急性心肌梗塞 (AMI)患者血清cTnI,并与国外同类产品比较 ,两者符合率为 93 6 %。结论 :该方法快速检测cTnI特异性强 ,灵敏度高 ,简便 。

人心肌肌钙蛋白I化学发光免疫分析方法的建立

目的 建立检测人心肌肌钙蛋白I(cTnI)化学发光免疫分析方法。方法 用重组cTnI免疫新西兰兔获得抗体 ,经DEAE 2 3层析和 (NH4) 2 SO4沉淀纯化后 ,用碳化二亚胺 (EDC)法标记辣根过氧化物酶 ,SephadexG 2 0 0纯化。优化鲁米诺 H2 O2 肉桂酸发光体系 ,建立了cTnI化学发光免疫分析法。用该法检测 138例正常人及病人血清标本 ,确定正常值参考范围 ,并与ELISA法比较。结果 所得抗体的滴度为 1∶80 0 0。优化后的发光体系为 :鲁米诺 (4 .5mmol/L) ,H2 O2 (7.5mmol/L) ,四苯硼钠 (0 .8mmol/L) ,肉桂酸 (0 .4mmol/L) ,比单独用肉桂酸或四苯硼钠作增强剂灵敏度分别增加了 1.19和 1.0 5倍。本法检测灵敏度为0 .2ng/ml,线性范围为 0 .4～ 5 0ng/ml,批内CV平均 9.0 % ,批间CV平均 11.8% ,回收率为 10 4 .2 %。Hb浓度在 0～ 5 0nmol/L ,T Bil在 0～ 15 μmol/L ,TG在 0～ 2 .0mmol/L对测定结果无影响。与ELISA比较 ,两法结果一致 (P >0 0 5 ) ,相关系数r=0 .985 2(P <0 .0 1)。用BioCheck标准品为校正物 ,确定临床诊断参考范围为 <2 .12ng/ml,诊断符合率为 96 .2 %。结论 建立的cTnI化学发光免疫分析法可常规用于临床检验。

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化。方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI。在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定。结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrap Kit成功纯化目的蛋白。ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性。结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的cDNA,构建成表达重组体导入特定宿主菌,以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白I,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA,并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni-NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因,构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达,经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。

抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体制备中免疫抗原的选取

目的 获得与人骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ没有交叉反应的抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ (HcTnⅠ )特殊位点的单克隆抗体。方法 选择了包括牛心肌肌钙蛋白Ⅰ (BcTnⅠ )、根据HcTnⅠ氨基酸序列的亲水性设计的 4个钥孔虫戚血蓝蛋白 (KLH)偶联肽段和一个八倍体多肽分子 (MAP)等 6种代用抗原 ,通过免疫、杂交和筛选 ,获得了能分泌抗 (HcTnⅠ )的IgG型抗体的杂交瘤细胞株 ,并对得到的抗体进行了特异性鉴定。结果 用其中 4种抗原免疫得到了抗HcTnⅠ的IgG型单抗的细胞株 ,其中的 3种合成肽可以得到分泌抗HcTnⅠ特殊位点的IgG型单抗细胞株。结论 为临床上检测cTnⅠ以诊断急性心肌梗塞 。

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)基因原核表达载体的构建,获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化,纯化后的融合蛋白免疫小鼠,制备抗血清。通过ELISA,Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnⅠ的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnⅠ蛋白并制备了其特异性抗体。

心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体间接酶联免疫吸附分析法的建立

目的建立以重组心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测人血循环中的抗cTnI自身抗体,为判断心肌损伤的预后提供依据。方法采用自行构建表达的cTnI-C融合蛋白作为包被抗原,以棋盘法优化实验条件,建立检测人血清cTnI自身抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA法在121例急性心肌梗死(AMI)中筛查抗cTnI自身抗体,并用蛋白印迹法(WB)进行确证。结果 121例AMI血清抗cTnI抗体的阳性率为10.74%,ELISA试验的灵敏度100%,特异性95.37%,Kappa值为0.815。结论以cTnI-C融合蛋白作为包被蛋白建立的间接ELISA法具有良好的敏感度、特异性,可用于人血清抗cTnI自身抗体的筛查。

人心肌肌钙蛋白在临床应用中的研究进展

人心肌组织受到微小损伤时即可在血液中检测到心肌肌钙蛋白（cTn）,cTn具有特异性高、敏感性好的特点。现有研究发现,cTn不仅是ACS的生物标志物,在非ACS心血管疾病甚至非心血管疾病中也有升高的情况。cTn检测方法多种多样,检测标准化的问题亟待解决。

人心肌特异性肌钙蛋白T单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人心肌肌钙蛋白T的单克隆抗体。方法 利用纯化的人心肌肌钙蛋白T免疫BALB/C小鼠 ,常规方法制备抗人心肌肌钙蛋白的单克隆抗体 2株N15C和N16D。结果 利用普通ELISA方法检测 2株单抗 ,小鼠腹水N16D滴度可达 1/ 32 0 0 0 ,N15C滴度达 1/ 80 0 0 ;斑点酶联免疫吸附试验证明N16D对急性心肌梗塞患者血清中出现的肌钙蛋白T有较好的亲和性。

斑点酶标法检测血清中人心肌特异性肌钙蛋白方法的建立

目的 建立人血清中肌钙蛋白的检测方法。方法 将倍比稀释后的待检血清 2μl滴加于硝酸纤维膜上的方格内 ,5 %牛血清白蛋白 50℃下 30min封闭硝酸纤维膜 ,然后将该膜浸于 1∶1 0 0稀释的辣根过氧化物酶 (HRP)标记的抗人心肌肌钙蛋白的单克隆抗体N1 5C ,N1 6D ,37℃反应 40min后 0 .0 35MPBS -T液振荡洗涤 3次 ,每次 5min ,其后将膜浸入显色液中显色后水洗终止反应。目测判读结果。结果 辣根过氧化物酶标记的N1 5C单克隆抗体检测心肌梗塞患者血清 ,患者血清最高稀释为 1∶8,N1 6D检测患者血清时 ,血清稀释度可达 1∶64 ,用 2株单抗检测时正常人血清均无斑点出现。结论 由抗人心肌肌钙蛋白的单克隆抗体N1

人心肌肌钙蛋白纯化方法的对比研究

目的比较两种心肌肌钙蛋白纯化方法。方法取意外死亡者心脏，分别采用醇、醚处理和加热处理两种不同方法进行人心肌肌钙蛋白（ＣＴｎＴ）的提取纯化。结果醇醚处理法提取周期较长、步骤繁琐，但经初步纯化后，杂蛋白含量较低，１００ｇ人心室肌组织可提取３５．３ｍｇＣＴｎＴ；加热法步骤简单，提取时间较短，但得率较低，１００ｇ人心室肌组织可提取１１．７９ｍｇＣＴｎＴ，而且粗品内含较多杂蛋白成分。结论两种方法各有优缺点。

不同酶标反应板在人心肌特异性肌钙蛋白抗体检测中的性能分析

目的 考察不同种类的酶标反应板对酶联免疫吸附试验 (ELISA)的结果影响。方法 以 10 0 μl人心肌肌钙蛋白T(CTnT)为抗原 ,分别包被不同酶标反应板 ,运用普通酶联免疫吸附试验方法比较不同酶标反应板的性能。结果 96孔硬脂进口反应板的CTnT抗体OD值 (P <0 .0 5 )和阴性血清OD值 (P <0 .0 1)高于国产 40孔硬板。结论 96孔进口硬板的吸附能力最强 ,灵敏度高 。

人心肌肌钙蛋白T亚型的克隆及表达

目的 构建人心肌肌钙蛋白T(cTnT)亚型的重组载体。 方法 应用RT-PCR技术，从人胚胎心肌组织中扩增cTnT1及cTnT2基因，连接到T Easy vector载体上，筛选重组子。结果 成功地扩增出cTnT1（764 bp）及cTnT2(124)基因片段，经测序证实，构建pExSecI-cTnT1表达载体并获得表达。结论 获得单一亚型的cTnT1及cTnT2基因片段，为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病关系提供了依据。