长链非编码RNA-MEG3在人心脏微血管内皮细胞缺氧损伤中的作用

目的研究长链非编码RNA-MEG3在人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)缺氧损伤中的作用。方法将HCMEC分为对照组、缺氧/复氧(H/R)组及缺氧/复氧联合MEG3敲减(H/R+siMEG3)组。荧光定量PCR检测MEG3及炎性因子的表达情况[白介素1β(IL-β)、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF-α)];CCK-8检测HCMEC细胞的增殖活性;流式细胞术分析细胞凋亡情况;Western blotting检测PI3K/AKT/eNOS信号通路表达变化,ELISA检测一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、血管内皮生长因子(VEGF)和活性氧(ROS)表达水平。结果利用qPCR检测对照组及H/R组细胞MEG3表达,结果发现:H/R组MEG3相对表达倍数[(6.87±0.239)倍]较对照组MEG3表达倍数(1.00±0.026)倍显著升高(n=3,t=42.32,P<0.0001),提示MEG3可能在心脏微血管内皮细胞IRI中起到重要作用。H/R组细胞与对照组比较,细胞增殖活性显著减弱(P<0.01);而H/R+siMEG3组与H/R组比较,细胞增殖活性进步受到抑制(P<0.01)。H/R组较对照组PI3K、AKT及eNOS磷酸化水平显著减低,而H/R+siMEG3组细胞较H/R组磷酸化水平更低(P<0.05)。H/R组与对照组比较,NO、SOD及VEGF显著减低,而ROS水平升高(P<0.05);而H/R+siMEG3组与H/R组比较,NO、SOD及VEGF水平进步下降,ROS升高显著。利用qPCR检测各处理组细胞相关炎症基因表达,结果发现:H/R组较对照组基因表达显著升高(P<0.05);H/R+SiMEG3组较H/R组基因表达进一步升高(P<0.01)。结论长链非编码RNA-MEG3在心脏微血管内皮细胞H/R损伤过程中起到重要保护作用,靶向提升MEG3水平有望成为减缓心脏微血管IRI的潜在治疗靶点。

灯盏花乙素上调细胞外信号调节激酶表达拮抗人心脏微血管内皮细胞IR损伤

目的灯盏花乙素(SCU)可拮抗心肌IR损伤,但SCU是否通过细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路拮抗IR所致血管内皮细胞损伤尚不清楚。文中探讨SCU在缺氧-复氧(HR)诱导的人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)损伤中的作用及对ERK1/2信号通路的影响。方法体外培养的HCMEC分别进行正常培养和缺氧12 h-复氧12 h建立IR模型(HR)处理。正常培养条件下,将HCMEC分为正常对照组、DMSO组、SCU 1μmol/L组和SCU 10μmol/L组。给予HCMEC IR损伤处理后,分为空白对照组、HR模型组、HR+DMSO组、HR+SCU 1μmol/L组和HR+SCU 10μmol/L组。将HCMEC与SCU或DMSO预孵育2 h后行HR处理。采用MTT法和锥虫蓝染色检测细胞存活率,并检测HCMEC的丙二醛(MDA)浓度。Western blot检测p-ERK1/2、ERK2和GAPDH蛋白表达情况。结果 MTT检测结果显示,与正常对照组细胞存活率(100%)比较,SCU 1μmol/L组和SCU 10μmol/L组[(110.40±2.34)%和(122±1.25)%]均增加(P<0.05);与空白对照组细胞活力(100%)比较,HR模型组[(68.00±4.06)%]下降(P<0.05),与HR模型组细胞存活率比较,HR+SCU 1μmol/L组和HR+SCU 10μmol/L组[(90.53±3.67)%、(92.04±2.32)%]增加(P<0.05)。锥虫蓝染色显示,与正常对照组细胞活力[(90.06±1.85)%]比较,SCU 10μmol/L组[(96.78±2.01)%]增加(P<0.05);与空白对照组[(91.83±2.34)%]比较,HR模型组细胞存活率[(73.72±4.91)%]下降(P<0.01),与HR模型组比较,HR+SCU 10μmol/L组细胞存活率[(87.59±2.64)%]增加(P<0.05)。与空白对照组比较,HR模型组、HR+DMSO组MDA明显增加(P<0.01);与HR模型组比较,HR+SCU 1μmol/L组和HR+SCU 10μmol/L组MDA含量减少(P<0.05)。与空白对照组比较,HR模型组p-ERK1/2蛋白表达明显降低(P<0.01);与HR模型组比较,HR+SCU 10μmol/L组p-ERK1/2蛋白表达明显增加(P<0.01)。结论 HR损伤导致HCMEC细胞活力下降、MDA增加和p-ERK1/2蛋白表达降低,SCU通过上调p-ERK1/2表达而拮抗HCMEC IR损伤。

黄芪多糖对缺氧/复氧人心脏微血管内皮细胞凋亡、细胞周期的影响

目的探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对缺氧/复氧人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cell,HCMEC)凋亡、细胞周期的影响。方法培养原代HCMEC,通过缺氧/复氧刺激HCMEC,模拟缺血再灌注损伤,建立缺血再灌注损伤模型。将造模成功的HCMEC随机分为5组:对照组、模型组、APS低浓度组(25μg/ml)、APS中浓度组(50μg/ml)和APS高浓度组(100μg/ml)。通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。通过蛋白质印迹法测定caspase-3、caspase-9蛋白表达水平。结果模型组细胞凋亡率显著高于对照组和APS低、中、高浓度组(均P<0.01)。模型组S期细胞显著增加,细胞在S期被阻滞并促进了细胞凋亡,但APS逆转了这一现象。模型组caspase-3和caspase-9蛋白表达水平均显著高于对照组和APS低、中、高浓度组(均P<0.05)。结论APS可保护HCMEC免受缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与改变细胞周期分布、调节caspase-3和caspase-9蛋白表达有关。

miR-330-5p负性调控ADAM17基因抑制人心脏微血管内皮细胞的间质转化

目的探讨人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)间质转化(EndMT)过程中miR-330-5p和ADAM17基因的表达,阐明miR-330-5p对EndMT的影响。方法培养HCMEC,应用TGF-β1诱导后,利用免疫荧光化学检测CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在细胞中的表达。运用生物信息学方法对miR-330-5p和ADAM17基因的配对关系进行预测。脂质体2000转染miR-330-5p模拟物后,Real-time PCR检测miR-330-5p、ADAM17和α-SMA mRNA的表达,Western blotting检测ADAM17和α-SMA蛋白的表达。结果光镜下可见诱导后细胞由鹅卵石形态变为长梭形,免疫荧光化学显示诱导前有强烈的CD31表达,诱导后出现α-SMA的高表达。生物信息学软件TargetScan和miRanYda显示miR-330-5p和ADAM17基因二者靶向配对良好。Real-time PCR和Western blotting检测结果均表明过表达miR-330-5p能够降低ADAM17和α-SMA mRNA及蛋白的表达。结论 miR-330-5p通过下调人心脏微血管内皮细胞中ADAM17基因的表达,进而抑制TGF-β1诱导的EndMT。

黄芪多糖联合lncRNA TUG1沉默对缺血再灌注人心脏微血管内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨黄芪多糖联合长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸调节基因1(TUG1)沉默对缺血再灌注人心脏微血管内皮细胞凋亡的影响。方法:将心脏微血管内皮细胞分成对照组、模型组、sh-NC组、sh-TUG1组、黄芪多糖组、黄芪多糖+sh-TUG1组,流式细胞术检测凋亡,Western Blotting方法检测音速豪猪蛋白(SHH)表达,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)含量。结果:与对照组比较,模型组心脏微血管内皮细胞凋亡率升高,TNF-α增多,ROS升高,SHH蛋白表达降低(均P<0.05);与sh-NC组比较,sh-TUG1组心脏微血管内皮细胞凋亡率降低,TNF-α减少,ROS含量降低,SHH蛋白表达升高(均P<0.05);与模型组比较,黄芪多糖组心脏微血管内皮细胞凋亡率降低,TNF-α减少,ROS降低,SHH蛋白表达升高(均P<0.05);与sh-TUG1组、黄芪多糖组比较,黄芪多糖+sh-TUG1组心脏微血管内皮细胞凋亡率降低,TNF-α减少,ROS含量降低,SHH蛋白表达升高(均P<0.05)。结论:黄芪多糖联合TUG1基因沉默能减少缺血再灌注人心脏微血管内皮细胞凋亡,减轻氧化损伤,抑制炎症介质分泌,其机制可能与激活SHH信号通路有关。

黄芪多糖对缺氧再复氧后人心脏微血管内皮细胞ICAM-1 VCAM-1表达的影响

目的：观察黄芪多糖对缺氧再复氧损伤的人心脏微血管内皮细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）蛋白表达的影响。方法：以体外缺氧缺糖模拟体内缺血,复氧复糖模拟再灌注复制缺血再灌注损伤模型;采用免疫细胞化学法和图象定量分析系统观察ICAM-1、VCAM-1蛋白表达的变化。结果：人心脏微血管内皮细胞复苏48-72h后呈铺路石样生长,在15个细胞倍增周期内,其形态、生物、生理学特性稳定。与正常对照组比较,缺氧再复氧可明显增加ICAM-1、VCAM-1蛋白在人心脏微血管内皮细胞的表达（P〈0.01）。黄芪多糖能降低两者的表达,其中100μg/mL抑制ICAM-1表达的作用显著（P〈0.05）,100、50μg/mL减少VCAM-1表达的作用明显（P〈0.01）。结论：黄芪多糖通过减少缺血再灌注损伤的人心脏微血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制白细胞的浸润,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。

黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞缺氧再复氧损伤后核因子-κB表达的影响

目的:观察人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)缺血再灌注损伤后核因子-κB(NF-κB)的表达变化,探讨黄芪多糖治疗心肌缺血再灌注损伤的机制。方法:以体外缺氧再复氧复制缺血再灌注损伤模型。免疫细胞化学染色法观察NF-κB的蛋白分布,荧光实时定量PCR检测NF-κB mRNA的表达。结果:缺氧再复氧后,NF-κB发生核转位,其mRNA表达较正常对照组明显增加(P<0.05)。黄芪多糖可抑制NF-κB的核转位,并降低NF-κBmRNA的表达,其中黄芪多糖50μg/mL剂量组降低NF-κBmRNA表达的作用与缺氧再复氧组比较差异显著(P<0.05)。结论:黄芪多糖通过抑制缺氧再复氧后HCMEC的NF-κB信号通路,降低炎症相关基因的激活,从而减轻心肌缺血再灌注损伤时的炎症反应。

人心脏微血管内皮细胞血管细胞黏附分子1及核因子κB在缺氧再复氧损伤后的表达与黄芪多糖的干预

目的:前期对整体动物的研究发现,黄芪多糖具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用。此次主要定量测定人心脏微血管内皮细胞血管细胞黏附分子1及核因子κB mRNA的表达,探讨黄芪多糖治疗心肌缺血再灌注损伤的机制。方法:实验于2007-01/03在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成。①实验材料:原代人心脏微血管内皮细胞(ScienCell公司:从人心肌组织中分离后立即冻存)。②实验过程及分组:以体外缺氧再复氧复制缺血再灌注损伤模型。将细胞分为4组:正常对照组、再灌注损伤组、黄芪多糖组(分为100,50,25mg/L3个亚组,在缺氧/复氧的同时加入相应浓度的药物)及吡咯烷二硫代氨基甲酸组(50μmol/L,于缺氧前加入,预处理30min后吸弃)。③实验评估:应用实时荧光定量聚合酶链反应检测血管细胞黏附分子1和核因子κB mRNA表达的变化。结果:①人心脏微血管内皮细胞的培养:复苏16h细胞散在分布,胞体肥厚、透明,呈菱形或多角形;36h形成多个小岛样克隆;48～72h细胞约85%融合,呈铺路石样生长。②实时荧光定量聚合酶链反应:扩增动力曲线平滑,每条曲线均有较明显的指数扩增期;扩增回归曲线的回归系数均>0.990,起始模版浓度与Ct值之间呈良好的线性关系。与正常对照组比,缺氧再复氧可明显增加人心脏微血管内皮细胞中血管细胞黏附分子1和核因子κB mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。黄芪多糖各剂量组均明显抑制缺氧再复氧后人心脏微血管内皮细胞上血管细胞黏附分子1mRNA的表达(P<0.01);核因子κB mRNA的表达在黄芪多糖50mg/L剂量组中降低(P<0.05)。结论:黄芪多糖能够抑制再灌注损伤的人心脏微血管内皮细胞中血管细胞黏附分子1及核因子κB mRNA的表达,从而减轻内皮细胞的炎症反应及黏附作用,改善心肌缺血再灌注损伤。

灯盏花乙素对人心脏微血管内皮细胞中PKCε表达的调控作用

目的探讨灯盏花乙素(scutellarin,SCU)对正常及缺氧再给氧(hypoxia reoxygenation,HR)处理时人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)中PKCε蛋白及m RNA表达的调控作用.方法以正常与缺氧再给氧2种方式培养HCMECs,实验分组为:在正常培养实验中分为正常对照(Control)组、SCU(0.1μM,1μM,10μM)3种剂量组;HR培养实验中分为Control组、Model(HR)组、HR处理的SCU(0.1μM,1μM,10μM)3种剂量组.分别以Western blot与RT-PCR方法检测HCMECs中p-PKCε与PKCε蛋白与m RNA表达的变化.结果在正常培养的HCMECs中,SCU(0.1μM,1μM,10μM)剂量组均可显著上调PKCε的蛋白及m RNA的表达(P<0.05),对p-PKCε也有上调趋势;在HR培养的细胞实验中,Model组PKCε有下调趋势,而SCU 10μM组可显著上调PKCε的蛋白及m RNA的表达(P<0.05),并且SCU 10μM亦可显著上调p-PKCε(P<0.05).结论 SCU对正常及HR处理时HCMECs中PKCε蛋白及m RNA的表达有明显的上调作用.

黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖及再灌注后内皮细胞与中性粒细胞黏附的影响

目的:观察黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞的增殖效应及其对再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与人外周血中性粒细胞黏附作用的影响。方法:实验于2006-07/12在北京中医药大学东直门医院中医内科重点实验室完成。①实验材料:原代人心脏微血管内皮细胞(ScienCell公司);黄芪多糖(惠州市东方植物保健科技有限公司)。②实验过程及评估:实验使用体外培养的人心脏微血管内皮细胞第4,5代细胞,采用倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况;以四甲基偶氮唑盐法检测经不同浓度黄芪多糖处理24h,以及经黄芪多糖100,50,25mg/L分别处理4,6,8h后的增殖变化;以体外缺糖缺氧2h模拟体内缺血,复糖复氧6h模拟再灌注复制人心脏微血管内皮细胞再灌注损伤模型;虎红法测定经缺氧再复氧处理后的人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附;免疫细胞化学法和图象定量分析系统观察细胞间黏附分子1的蛋白表达变化。结果:①人心脏微血管内皮细胞形态和生长情况:人心脏微血管内皮细胞复苏48～72h后细胞呈铺路石样生长,在15个细胞倍增周期内,其形态、生物、生理学特性稳定。②不同浓度黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:黄芪多糖浓度≥5g/L时,对细胞生长具有抑制作用(P<0.05或0.01);浓度为2.5g/L时,对细胞的增殖无影响;浓度在1.25g/L～18.78mg/L时,可明显促进细胞的增殖(P<0.05或0.01)。③黄芪多糖处理不同时间对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:经黄芪多糖100,50,25mg/L3个剂量分别处理4,6,8h后,其增殖与正常对照组比无明显变化。④黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞与中性粒细胞间黏附作用及人心脏微血管内皮细胞细胞间黏附分子1蛋白表达的影响:黄芪多糖50mg/L可显著抑制再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附(P<0.01);100mg/L可明显降低人心脏微血管内皮细胞的细胞间黏附分子1蛋白表达(P<0.05)。结论:①黄芪多糖在一定浓度范围内可促进人心脏微血管内皮细胞的增殖,但需较长的作用时间才能发挥促增殖效应。②黄芪多糖对缺血再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞具有保护作用,其作用机制可能与促进再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞增殖修复,降低人心脏微血管内皮细胞表面细胞间黏附分子1蛋白表达,进而抑制与外周血中性粒细胞的黏附有关。

血管紧张素Ⅱ对人心脏微血管内皮细胞神经调节蛋白1表达和分泌的影响

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人源性心脏微血管内皮细胞(HCMECs)的影响。方法:在正常培养条件下,将100 nmol/L AngⅡ加入细胞中,与HCMECs共孵育12h,用蛋白印迹法检测和细胞酶联免疫法分别检测神经调节蛋白1(NRG-1)的蛋白表达和神经调节蛋白1亚集(NRG-1β)分泌情况。结果:与空白组比较,AngⅡ处理组的NRG-1的蛋白表达和NRG-1β的分泌降低(P<0.05)。结论:AngⅡ能减少HCMECs的NRG-1的表达和NRG-1β分泌。

基于人心脏微血管内皮细胞的黄芪多糖分子调控机制研究

目的:探究基于人心脏微血管内皮细胞的黄芪多糖分子调控机制。方法:选择2019年1月至2020年12月在洛阳东方医院进行体外培养的人心脏微血管内皮细胞第4、5代为观察对象,通过染色法、细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫化学法等,对黄芪多糖分子的调控机制进行观察分析。结果:黄芪多糖会对人心脏微血管内皮细胞的表面黏附分子产生作用,主要是细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达能够得到促进,差异具有统计学意义(P<0.05),并且对于淋巴细胞表面CD18表达没有明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在人心脏微血管内皮细胞环境中,黄芪多糖分子可以很好地提升细胞表面黏附分子的表达,有益于淋巴细胞的再循环,并且让淋巴细胞与内皮细胞的黏附作用得到促进,是黄芪多糖分子起到免疫增强作用的重要表现。

中药保护心脏微血管内皮细胞在慢性冠脉综合征治疗中的研究进展

心脏微血管内皮细胞是心脏微血管系统的重要组成部分,在冠状动脉粥样硬化、急性心肌梗死后无复流及再灌注损伤、微血管性心绞痛、缺血性心律失常、心肌梗死后心力衰竭等慢性冠脉综合征(CCS)的发生发展的过程中具有重要作用。本研究基于当前证据对心脏微血管内皮细胞与CCS的发病机制以及中药复方及单体抑制心脏微血管内皮细胞损伤的相关研究机制进行综述,以期为临床提供参考。

卡巴胆碱对失血性休克大鼠肺微血管内皮细胞功能的影响

目的 观察大鼠失血性休克时卡巴胆碱对肺微血管内皮细胞的作用。方法 将30只健康雄性SD大鼠(SPF级)按每组10只随机分为假休克组(SS组)、失血性休克组(HS组)、失血性休克+卡巴胆碱组(CBL组)。失血性休克动物模型按照Wiggers改良法制作,各组模型制备完毕后6 h,经右侧股动脉采血,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,取右肺下叶肺组织检测Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)、E-选择素蛋白质水平,取右肺下叶行透射电镜检查肺微血管内皮细胞超微结构。结果 SS组表达少量的TNF-α、SSeCKS、E-选择素,HS组和CBL组表达升高(P<0.05),与HS组相比,CBL组表达降低(P<0.05)。SS组肺微血管内皮细胞细胞膜表面光滑,细胞膜、细胞质、细胞核形态结构正常;HS组肺微血管内皮细胞出现细胞水肿、坏死和凋亡表现(细胞膜表面皱折、细胞膜表面凹凸不平、细胞器水肿、异染色质染色加深边集等);CBL组较SS组,细胞有所损伤,但好于HS组。结论 大鼠失血性休克时卡巴胆碱对肺微血管内皮细胞具有保护作用,也可通过抑制炎症细胞合成和释放炎症介质减轻对血管内皮细胞的损伤。

过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OGD3h/R3h损伤细胞)、BIRC5干预组(细胞预先转染腺病毒-BIRC5质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MTT法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用RT-PCR和免疫印迹法分别检测各组细胞BIRC5和VEGF mRNA及蛋白表达。结果正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;BIRC5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达BIRC5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组和阴性对照组的BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组细胞BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达BIRC5基因对OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调VEGF表达有关,提示BIRC5调控VEGF表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

基于内皮细胞功能障碍探讨糖尿病微血管病变“微型癥瘕”病机理论的科学内涵

基于中医理论及当前科学研究发现,糖尿病微血管病变内皮细胞功能障碍与中医“微型癥瘕”病机理论存在着深刻的联系。糖尿病热伤气阴,病久入络后可致血脉气血阴阳亏虚,人体正气亏虚,瘕聚阶段无形可查;持续进展可致痰、热、郁、瘀痼结于络脉形成癥积而有形可征。国医大师吕仁和教授称之为“微型癥瘕”病机理论,其中正气亏虚是瘕聚发生的基础,痰热郁瘀是癥积形成的关键,这与微血管在内皮细胞功能异常的基础上进一步进展至结构改变,最终导致糖尿病微血管内皮细胞功能障碍的病理过程相一致。内皮细胞功能异常与结构改变可视为正气亏虚及痰热郁瘀的微观体现,共同诠释糖尿病微血管病变“微型癥瘕”病机理论的科学内涵。此认识可为中医药防治糖尿病微血管病变提供新的研究角度和方向,为临床和科研的开展提供充分的理论支撑。

脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨低氧微环境诱导下脂肪间充质干细胞(ADSCs)外囊泡(Evs)通过增加微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达对人微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:分离大鼠ADSCs,并通过成骨、成脂分化和细胞表面标志物的表达进行鉴定。利用常氧(21%O2)和低氧(1%O2)条件分别获得常氧Evs和低氧Evs,通过形态和表面标志物的表达进行鉴定。构建心肌微血管内皮细胞(CMECs)细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,并将CMECs分为对照组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R组)、常氧Evs组(N-Evs组,给予常氧Evs培养24 h)、低氧Evs组(H-Evs组,给予低氧Evs培养24 h)、低氧Evs+自噬抑制剂组(H-Evs+3-MA组,给予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培养24 h)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验和透射电镜分别检测CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力;采用酶联免疫吸附法(Western Blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、基质金属蛋白酶(MMP)-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、LC3B、重组人自噬效应蛋白1(Beclin1)蛋白表达。结果:与Control组比较,OGD/R组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。与OGD/R组比较,N-Evs组和H-Evs组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力增强(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加(P<0.05),且H-Evs组优于N-Evs组(P<0.05)。与H-Evs组比较,H-Evs+3-MA组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。结论:低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达可促进OGD/R损伤CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。

天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨天麻素(Gas)、薯蓣皂苷元(Dio)及其组合物(GDC)对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用和对脑微血管新生的影响及其作用机制。方法将BMECs分为5组:正常对照组,模型对照组,Gas组(1、2、4、8、16、32μmol·L^(-1)),Dio组(0.25、0.5、1、2、4、8μmol·L^(-1)),GDC组(Gas和Dio浓度分别为1和0.25、2和0.5、4和1、8和2、16和4、32和8μmol·L^(-1))。分组给药12 h后,对模型对照组、Gas组、Dio组和GDC组通过氧糖剥夺法建立BMECs缺氧模型。检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、白细胞介素1β(IL-1β)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度;观察Hoechst 33258、FITC-Annexin V/PI染色,采用Transwell小室实验、细胞划痕实验和小管形成实验,考察Gas、Dio及GDC对缺氧损伤BMECs的保护作用及促进血管新生作用。进一步利用网络药理学和分子对接方法研究GDC抗脑缺血的作用机制。结果Gas、Dio以2、0.5μmol·L^(-1)组合时,可显著提高缺氧损伤BMECs细胞活力(P<0.05),促进细胞增殖;与模型对照组比较,Gas组LDH漏出率降低(P<0.05);Gas组、Dio组与GDC组IL-1β含量均显著下降(均P<0.05),Gas组、GDC组SOD活力升高(P<0.05),Gas组、Dio组以及GDC组凋亡小体减少。GDC可促进BMECs缺氧模型的增殖、侵袭、迁移以及小管形成,表明其在细胞水平上一定程度促进血管新生。网络药理学研究发现,Gas与半胱天冬酶3(CASP3)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、凝血因子Ⅱ(F2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)1蛋白具有良好的结合活性,Dio与内皮一氧化氮合成酶(NOS3)、KDR蛋白具有良好的结合活性,Gas、Dio可能主要通过血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路以及缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路调控脑缺血后血管新生。结论Gas、Dio及GDC具有抗缺氧损伤作用并可促进缺氧损伤后血管新生,作用机制可能与其作用于Akt1、NOS3、VEGFR2等蛋白,调控VEGF/Akt/MAPK等信号通路促进血管新生有关。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。