过表达CASP1诱导人急性髓系白血病细胞THP-1的G_(0)/G_(1)细胞周期阻滞和NLRP3炎性小体介导的焦亡

目的:探讨半胱天冬酶1(Caspase1,CASP1)对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞THP-1的细胞周期和细胞焦亡的影响。方法:培养THP-1细胞,将细胞分为对照组(正常培养的THP-1细胞),pcDNA3.1-null组(过表达CASP1的阴性对照,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-null质粒转染THP-1细胞24h)、pcDNA3.1-CASP1组(过表达CASP1,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-CASP1质粒转染THP-1细胞24h)。用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力。用流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期的变化。用qRT-PCR法检测细胞中CASP1、白细胞介素(interleukin,IL)-1β,IL-18的mRNA表达水平。用Western blot法检测细胞增殖相关蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、CASP1、切割半胱天冬酶1(cleaved-caspase 1,cleaved-CASP1)、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D的相对表达水平。结果:与对照组比,pcDNA3.1-null组的细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞周期变化均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比,pcDNA3.1-CASP1组的细胞凋亡变化无统计学意义(P>0.05),细胞的增殖活力减少,G_(0)/G_(1)细胞周期被阻滞,Ki67、PCNA、cyclin D1的相对表达水平均减少(P<0.05),NLRP3、ASC、CASP1、cleaved-CASP1、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D的相对表达水平均增加(P<0.05)。与pcDNA3.1-null组比,pcDNA3.1-CASP1组的细胞凋亡变化无统计学意义(P>0.05),细胞的增殖活力减少,G_(0)/G_(1)细胞周期被阻滞,Ki67、PCNA、cyclin D1的相对表达水平均减少(P<0.05),NLRP3、ASC、CASP1、cleaved-CASP1、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDA)的相对表达水平均增加(P<0.05)。结论:过表达CASP1诱导AML细胞THP-1的G_(0)/G_(1)细胞周期阻滞和NLRP3炎性小体介导的焦亡。

氯普噻吨调节Akt/mTOR通路对人急性髓系白血病细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨氯普噻吨通过调节蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对人急性髓系白血病(AML)细胞自噬和凋亡的影响。方法以SKNO-1、MOLM-13两个细胞系为研究对象,0、20、40、60μmol/L氯普噻吨分别处理SKNO-1、MOLM-13细胞6、12、24 h,CCK-8检测细胞增殖情况。实验分为4组,对照组正常培养、SC79组用5 mg/L SC79处理细胞2 h,氯普噻吨组用40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h,氯普噻吨+SC79组在SC79组基础上添加40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h。单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测自噬的发生情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质免疫印迹检测自噬相关蛋白SQSTM1/p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B),凋亡相关蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)、激活型caspase3(cleaved caspase3)以及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、磷酸化(p)-Akt、mTOR、p-mTOR表达情况。结果在SKNO-1、MOLM-13细胞中,6、12、24 h时,与0μmol/L氯普噻吨相比,20、40、60μmol/L氯普噻吨处理后细胞增殖抑制率升高(P<0.05);在同一时间点,随着氯普噻吨浓度的升高,细胞增殖抑制率升高,40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h进行接下来研究。在SKNO-1、MOLM-13细胞中,与对照组相比,SC79组细胞凋亡率、自噬小体阳性率,LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白表达水平降低(P<0.05),SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平升高(P<0.05);而氯普噻吨组表现出相反趋势(P<0.05);在SC79组基础上添加氯普噻吨,与氯普噻吨组相比,细胞凋亡率、自噬小体阳性率,LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白表达水平降低(P<0.05),SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论氯普噻吨能够抑制Akt/mTOR通路促进人AML细胞自噬和凋亡。

苦参碱联合化疗药物对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及侵袭力的影响

目的:探究苦参碱联合化疗药物对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及侵袭力的影响。方法:体外培养人急性髓系白血病HL-60细胞,苦参碱单药组以1.0 g/L苦参碱干预,三氧化二砷单药组以3μmol/L三氧化二砷处理,联合组以终浓度为1.0 g/L的苦参碱+3μmol/L三氧化二砷处理,空白组以等量生理盐水处理。MTT法检测HL-60细胞增殖情况,ranswell小室实验检测HL-60侵袭力,蛋白免疫印迹法检测HL-60细胞MMPs蛋白表达情况。结果:苦参碱单药组、三氧化二砷单药组、联合组24 h PIR分别为(18.54±2.54)%,(29.54±2.62)%,(41.45±3.72)%,48 h PIR分别为(27.46±2.55)%,(38.93±3.76)%,(45.64±3.54)%,3组内HL-60的PIR均随着培养时间的增加而增加,其中联合组24 h、48 h PIR均高于同时间点的苦参碱单药组、三氧化二砷单药组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白组、苦参碱单药组、三氧化二砷单药组、联合组侵袭细胞分别为(127.64±23.93)个、(94.24±15.23)个、(81.23±12.21)个、(75.13±10.69)个,相对侵袭指数分别为(100.00±0.00)%、(73.44±0.34)%、(62.47±0.15)%、(58.54±0.36)%;MMP-2蛋白相对表达量分别为(0.91±0.05)、(0.39±0.04)、(0.23±0.04)、(0.14±0.03);MMP-9蛋白相对表达量分别为(0.62±0.05)、(0.31±0.05)、(0.27±0.04)、(0.16±0.02)。与空白组比较,苦参碱单药组、三氧化二砷单药组、联合组侵袭细胞数量显著减少,相对侵袭指数及细胞中MMP-2、MMP-9相对表达量降低,且联合组均低于苦参碱单药组、三氧化二砷单药组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:苦参碱联合三氧化二砷通过下调MMP-2、MMP-9蛋白表达有效抑制人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及侵袭。

青蒿素基于PI3K/AKT信号通路对人急性髓系白血病细胞凋亡的作用机制

目的分析青蒿素基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路对人急性髓系白血病(AML)细胞凋亡的作用机制。方法以44例AML患儿原代细胞及K562细胞株4株为研究样本,平均分为对照组、实验组(分别加入12.5、25.0、50.0μg/ml青蒿琥酯),细胞计数法观察72h内细胞生长趋势,采用流式细胞术检测不同浓度青蒿琥酯对细胞凋亡的影响,免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白(PI3K、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN)的表达。结果AML原代细胞、细胞株K56224h内细胞存活率≥80%,对照组AML原代细胞、细胞株K56248~72h细胞存活率仍≥70%,而实验组AML原代细胞、细胞株K562培养48h细胞存活率均降至50%以下,且明显低于对照组(P<0.05);青蒿琥酯呈浓度依赖性诱导人AML原代细胞及K562细胞株凋亡,且25.0μg/ml组、50.0μg/ml组的细胞存活率低于12.5μg/ml组及对照组(P<0.05),25.0μg/ml组、50.0μg/ml组的细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养48h后,实验组原代细胞及K562细胞株的PI3K、P-AKT、Bcl-2均明显下调(P<0.05),而Bax、caspase-3、PTEN表达上调(P<0.05),且青蒿琥酯浓度为25.0μg/ml组各项指标变化最明显,AKT无明显变化(P>0.05)。结论青蒿素类衍生物青蒿琥酯可经PI3K/AKT信号通路调节其Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN等凋亡相关蛋白表达,促进人AML细胞凋亡,25μg/ml浓度时效果较佳。

升麻鳖甲汤加减方对人急性髓系白血病细胞诱导脐静脉内皮细胞迁移、趋化、管腔形成的影响

目的研究升麻鳖甲汤加减方在体外对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞株HL-60以及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响;随后以人急性髓系白血病细胞HL-60的培养上清对人脐静脉内皮细胞HUVEC进行诱导培养,并加入不同浓度的升麻鳖甲汤加减方进行干预,检测人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移、趋化、管腔形成能力的变化,从而揭示升麻鳖甲汤加减方对人急性髓系白血病细胞诱导的脐静脉内皮细胞迁移、趋化、管腔形成的影响。方法体外培养HL-60以及HUVEC细胞,待细胞进入对数生长期后进行相应实验;首先将不同浓度升麻鳖甲汤加减方在体外分别用于干预人急性髓系白血病细胞HL-60和人脐静脉内皮细胞HUVEC,在干预时间达48 h后,采用MTT法分别检测不同浓度升麻鳖甲汤加减方对HL-60以及HUVEC细胞增殖能力的影响;根据MTT实验的数据提示,选择适宜终浓度的升麻鳖甲汤加减方与HL-60细胞培养上清进行混合制备含药条件培养基用于干预HUVEC细胞,并分别运用划痕迁移、Transwell小室趋化以及Matrigel胶小管形成等实验方法观察HUVEC细胞经干预后的迁移、趋化效应以及成管能力的变化。结果不同浓度的升麻鳖甲汤加减方干预48 h后能够分别显著抑制HL-60以及HUVEC细胞的增殖(P<0.01),并且这种增殖抑制效应呈现出明显的时间-浓度依赖性,并且在HL-60和HUVEC两种细胞之间存在差异性细胞毒作用,即对HUVEC细胞的增殖抑制显著高于HL-60细胞(P<0.01);不同终浓度的升麻鳖甲汤加减方对由HL-60细胞上清诱导培养的HUVEC细胞的迁移运动能力均有不同程度的抑制作用(P<0.05),并且细胞迁移率随着药物浓度的增加而下降;细胞Transwell小室趋化实验结果显示,不同终浓度的升麻鳖甲汤加减方可显著降低HL-60细胞上清诱导培养的HUVEC细胞的趋化性(P<0.05);HUVEC细胞小管形成连接点、分支数量等均明显低于阳性对照组(P<0.01),小管形成抑制率随着药物浓度的增加而上升,且HUVEC细胞生成小管的连接点及分支数量与药物浓度呈负相关(P<0.01)。结论升麻鳖甲汤加减方可抑制HL-60及HUVEC细胞的增殖,并存在差异细胞毒作用,提示该复方可能具有抑制急性髓系白血病肿瘤血管形成的效应,而这种效应的产生可能与其抑制肿瘤血管内皮细胞的迁移、趋化及成管能力等相关。

二甲双胍抑制急性髓系白血病细胞增殖

目的探讨降糖药物二甲双胍对人急性髓系白血病细胞系U937细胞增殖的作用。方法将浓度梯度的二甲双胍(0、5、10、20、40、60 mmol·L^(-1))分别作用于U937细胞24、48 h,采用CCK-8试剂盒检测U937细胞活力,Annexin-V/PI assay试剂盒检测U937细胞凋亡率,JC-1检测U937细胞线粒体膜电位下降水平。同时基于细胞活力试验检测结果,将上述浓度梯度的二甲双胍分别作用于U937细胞48 h,采用Western blot检测Bcl-2蛋白表达水平。结果二甲双胍作用24 h对U937细胞增殖抑制作用较弱、无明显杀伤作用;作用48 h对U937细胞有抑制细胞生长、促进凋亡、降低线粒体膜电位作用,同时显著降低U937细胞Bcl-2蛋白水平。结论二甲双胍可杀伤人急性髓系白血病细胞系U937细胞。二甲双胍抗白血病作用可能与其下调线粒体膜电位、抑制Bcl-2蛋白表达有关。

双氢青蒿素人对急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的诱导作用

目的探讨双氢青蒿素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用和机制。方法用二甲氧唑黄细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测双氢青蒿素对HL-60细胞生长的抑制作用,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位变化,分光光度法检测细胞Caspase-3活性变化。结果双氢青蒿素对HL-60细胞生长有抑制作用,呈剂量依赖性,并能诱导HL-60细胞凋亡,使线粒体膜去极化,增强Caspase-3活性。结论双氢青蒿素能抑制人急性髓系白血病HL-60细胞生长,并诱导细胞凋亡,可能与线粒体凋亡通路有关。

COX-2抑制人急性髓系白血病OCI-AML2细胞株内p53、TNF-α的表达

目的探究抑制环氧化酶-2(COX-2)后对人急性髓系白血病OCI-AML2细胞增殖、凋亡的影响及其可能作用机制。方法体外培养人急性髓系白血病OCI-AML2细胞,细胞分为三组:空白对照组(不进行转染)、阴性对照(NC)组(转染阴性序列)、COX-2 RNAi组(转染COX-2 RNAi序列)。CCK-8法检测各组细胞增殖活性;流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡、周期分布情况,免疫印迹法检测细胞中COX-2、Cyclin D1、p21、p53、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果与空白对照组、阴性对照组比较,COX-2 RNAi组细胞COX-2蛋白表达(0.21±0.03)降低,细胞增殖抑制率(21.74±3.55)%、凋亡率(26.45±4.16)%升高,G1期细胞比例(44.17±1.36)%升高,S期(46.45±1.16)%、G2期(9.38±1.17)%细胞比例降低,p21(0.84±0.07)、p53(0.72±0.06)、Bax(1.26±0.15)蛋白表达升高,Cyclin D1(0.86±0.09)、TNF-α(0.45±0.08)、Bcl-2(0.24±0.03)蛋白表达降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抑制COX-2后能够抑制人急性髓系白血病OCI-AML2细胞增殖,促进其凋亡,使细胞周期阻滞于G1期,其机制可能是通过上调p53,下调TNF-α表达实现的。

PR结构域蛋白5过表达对人急性髓系白血病细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制

目的探讨PR结构域蛋白5(PRDM5)过表达对人急性髓系白血病(AML)细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制。方法收集20例AML患者(AML组)和20例健康志愿者(正常组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其骨髓样本中微小RNA(miR)-489-3p和PRDM5 mRNA表达水平。采用脂质体转染技术将人AML细胞系U937分为7组:pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PRDM5组、shNC组、shPRDM5组、NC组、miR-489-3p mimics组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组,采用划痕实验和侵袭迁移小室(Transwell小室)法分别检测各组细胞的迁移和侵袭能力;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测β-catenin和GSK3β蛋白表达水平。结果AML组受试者骨髓miR-489-3p表达水平低于正常组,PRDM5 mRNA表达水平高于正常组(P<0.05)。pcDNA3.1-PRDM5组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别高于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组,而GSK3β表达水平分别低于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组(P<0.05)。shPRDM5组和miR-489-3p mimics组的PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别低于shNC组和NC组,而GSK3β蛋白表达水平分别高于shNC组和NC组(P<0.05)。结论miR-489-3p靶向PRDM5基因阻断Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制人AML细胞系U937迁移侵袭。

STAT1信号通路在全反式维甲酸诱导人白血病细胞向粒细胞分化过程中的作用与机制

目的探讨信号转导与转录激活因子1(STAT1)信号通路在全反式维甲酸(ATRA)诱导人白血病细胞向粒细胞分化过程中的作用与机制,为白血病的临床治疗提供新的靶点与途径。方法将人急性髓系白血病细胞HL-60随机分为两组,观察组以ATRA(2μmol/L)诱导HL-60细胞向粒细胞分化,对照组加入相同浓度DMSO;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞表面CD11b表达,q-PCR法检测细胞STAT1、亮氨酸结构拉链转录因子ε(C/EBPε)mRNA,Western blotting法检测细胞STAT1蛋白及磷酸化(p-STAT1)水平,q-PCR法检测细胞miR-155-5p,Pearson相关性分析STAT1与miR-155-5p、C/EBPε表达的关系。结果与对照组比较,观察组诱导96 h后细胞体积变小,形状不规则,胞质增多,核浓缩,核仁变小或消失,分叶核显著增多。观察组ATRA诱导96 h时细胞表面CD11b阳性表达率为62.97%±1.90%,高于对照组的1.87%±0.08%(P<0.05)。与对照组比较,观察组ATRA诱导后48、72、96 h细胞中STAT1 mRNA、C/EBPεmRNA、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白表达增加(P均<0.05),而miR-155-5p表达降低(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示,细胞STAT1 mRNA与miR-155-5p相对表达量呈负相关(r=-0.90,P<0.05),与C/EBPεmRNA相对表达量呈正相关(r=0.96,P<0.05)。结论miR-155-5p反向调控STAT1信号通路,进而活化粒细胞分化转录因子C/EBPε,诱导HL-60细胞向粒细胞分化;STAT1活化可能是ATRA诱导HL-60细胞向粒细胞分化的关键机制之一,靶向调控STAT1信号通路可能成为诱导HL-60细胞向粒系分化的有效靶点。

醌茜素对急性髓系白血病THP-1细胞miR30b-p53信号通路的调控研究

目的研究醌茜素对急性髓系白血病THP-1细胞的影响及作用机制。方法体外培养急性髓系白血病THP-1细胞,低、高剂量实验组加入15,30μmol·L-1醌茜素溶液1μL处理,对照组以等量0.9%NaCl处理。以CCK-8法及DNA断裂的原位末端标记法检测THP-1细胞存活及凋亡情况;以蛋白质印迹法检测THP-1细胞中p53、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况;以实时荧光定量聚合酶链式反应检测THP-1细胞中miR30a、miR30b、miR30c、miR30d及p53 mRNA表达。结果干预72 h后,低、高剂量实验组和对照组THP-1细胞活率分别为(79.75±3.46)%,(67.88±6.43)%和(99.33±0.32)%,凋亡率分别为(32.06±4.05)%,(40.26±3.56)%和(1.36±0.21)%,Bax蛋白相对表达量分别为1.02±0.26,1.39±0.24和0.59±0.14,Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.96±0.28,0.36±0.05和1.26±0.32,p53蛋白相对表达量分别为2.03±0.26,3.05±0.37和1.39±0.24,miR30a mRNA表达量分别为0.52±0.06,0.26±0.05和0.63±0.05,miR30b mRNA表达量分别为0.69±0.03,0.42±0.03和0.75±0.03,miR30c mRNA表达量分别为0.56±0.02,0.26±0.01和0.66±0.03,p53 mRNA表达量分别为0.45±0.03,0.69±0.05和0.32±0.05,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论醌茜素可有效促进人急性髓系白血病THP-1细胞凋亡,抑制其增殖,其作用机制可能与调控miR30b-p53信号通路有关。

miR-23a-3p靶向SMC1A调控急性髓系白血病细胞的增殖迁移和凋亡能力及其作用机制

目的探讨miR-23a-3p靶向SMC1A调控人急性髓系白血病(AML)细胞的增殖、迁移和凋亡及其作用机制。方法微阵列分析筛选人AML细胞U937中差异表达的微小RNA和信使RNA,实时荧光定量PCR法检测miR-23a-3p和SMC1A在人AML细胞U937中的表达,TargetScan数据库分析miR-23a-3p与SMC1A的相关性,双荧光素酶报告基因检测miR-23a-3p与SMC1A的相互作用,克隆形成实验检测miR-23a-3p的表达对U937细胞增殖能力的影响,细胞划痕实验检测miR-23a-3p的表达对U937细胞迁移能力的影响,流式细胞术检测miR-23a-3p的表达对U937细胞的凋亡能力、凋亡周期和caspase-3活性的影响,Western blot法检测miR-23a-3p的表达对U937细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结果与人正常单核细胞SC(1.00)比较,U937细胞中miR-23a-3p的表达(2.56±0.78)上调(P<0.01),SMC1A的表达(0.48±0.56)下调(P<0.01);miR-23a-3p与SMC1A 3′UTR特异性结合,调控SMC1A的表达活性。miR-23a-3p过表达促进U937细胞增殖和迁移,抑制U937细胞的凋亡;而SMC1A上调抑制U937细胞的增殖和迁移,促进了U937细胞的凋亡。阴性对照组中G0/G1期、G2/M期和S期细胞比例分别为(37.48±0.21)%、(16.78±0.18)%和(45.74±0.15)%,miR-23a-3p mimics组分别为(19.96±0.11)%、(41.69±0.24)%和(38.24±0.34)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-23a-3p mimics+pcDNA3.1-SMC1A组中G0/G1期、G2/M期和S期细胞比例分别为(36.88±0.21)%、(30.44±0.33)%和(32.88±0.16)%,与miR-23a-3p mimics组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。阴性对照组中Bax和Bcl-2蛋白的相对表达水平分别为0.55±0.45和0.31±0.54,miR-23a-3p过表达抑制U937细胞中Bax蛋白的表达(0.23±0.13,P<0.001),促进Bcl-2蛋白的表达(0.50±0.23,P<0.01),而SMC1A上调促进U937细胞中Bax蛋白的表达(0.40±0.11,P<0.01),抑制Bcl-2蛋白的表达(0.37±0.15)。阴性对照组中caspase-3的活性为(25.82±0.89)%,miR-23a-3p过表达抑制U937细胞中caspase-3的活性[(3.64±0.56)%,P<0.01],而SMC1A上调促进U937细胞中caspase-3的活性[(15.29±0.85)%,P<0.01]。结论miR-23a-3p通过靶向SMC1A抑制人AML细胞的增殖和迁移,促进其凋亡。