芹菜素对人恶性黑素瘤A375细胞周期的影响及机制研究

目的研究芹菜素对人恶性黑素瘤细胞系A375细胞周期的影响,并进一步探讨其作用机制。方法 A375细胞经芹菜素干预后,MTT比色法检测芹菜素对细胞增殖的影响,PI单标流式细胞术检测芹菜素对细胞周期的影响,蛋白印迹法检测芹菜素对细胞周期相关蛋白Cyclin D1及p21表达的影响。结果芹菜素在体外能明显抑制A375细胞增殖,其抑制效应呈时间及浓度依赖性;芹菜素可影响A375细胞周期,经芹菜素干预的A375细胞,其细胞周期被阻滞于G1期;芹菜素可显著影响A375细胞周期相关蛋白的表达,芹菜素在下调A375细胞Cyclin D1表达的同时,明显上调p21蛋白的表达。结论芹菜素能拮抗人恶性黑素瘤A375细胞增殖,其机制可能与芹菜素影响A375细胞周期相关蛋白Cyclin D1/p21的表达进而调控A375细胞周期进程有关。

生存素反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的研究生存素反义寡核苷酸(AS-ODN)经脂质体介导转染对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法合成生存素硫代反义寡核苷酸(AS-ODN),脂质体携带转染人恶性黑素瘤A375细胞。采用台盼蓝计数、软琼脂克隆形成试验、电镜、流式细胞仪检测AS-ODN对A375细胞增殖及凋亡的影响。通过裸鼠致瘤实验观察AS-ODN对A375细胞动物体内增殖的抑制作用。结果生存素反义寡核苷酸能降低G2/M期细胞百分比,诱导细胞凋亡发生,明显抑制A375细胞的生长和克隆形成,裸鼠体内A375细胞恶性增殖潜力下降。结论脂质体介导生存素AS-ODN能有效抑制A375细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。

FRET技术检测藤黄酸诱导的人恶性黑素瘤A375细胞凋亡

荧光共振能量转移（FRET）技术是近几年被广泛运用实时动态监测蛋白质时空动力学的一项新技术。目前国内应用FRET技术在蛋白酶活性检测方面取得较好进展。研究表明，藤黄酸（gambogic acid，GA）对多种肿瘤具有较强的抗肿瘤活性。藤黄酸是否具有抗黑素瘤效应，目前报道不多。本实验通过体外培养人恶性黑素瘤A375细胞，应用FRET技术动态监测不同浓度藤黄酸处理后活细胞内Caspase-3的活性，了解藤黄酸对A375细胞的凋亡诱导作用。

下调microRNA-192基因表达对恶性黑素瘤A375细胞增殖及早期凋亡的影响

目的:研究microRNA-192基因表达降低与恶性黑素瘤A375细胞增殖及凋亡的关系。方法:除空白对照组外,运用脂质体介导法将空载体和为microRNA-192设计的small interfering RNA(si RNA)转染到恶性黑素瘤A375细胞中,并利用实时定量PCR检测microRNA-192的表达。通过形态学观察、细胞计数法、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法以及流式细胞免疫学等方法,分析空白对照组、空载体对照组(lipofectamine2000)和实验组恶性黑素瘤A375细胞的增殖和早期凋亡情况。结果:空白对照组和空载体对照组之间相比较,细胞增殖和凋亡情况几乎一致,差异无统计学意义。与空载体对照组相比,实验组存活的恶性黑素瘤A375细胞的活性和数量明显降低,此现象并随着si RNA浓度的提高而愈发明显。另外,实验组恶性黑素瘤A375细胞细胞凋亡指数较空载体对照组明显升高。结论:通过下调恶性黑素瘤细胞中microRNA-192基因表达可能会有效地抑制恶性黑素瘤的生长并促使其细胞凋亡。

三氧化二砷对人恶性黑素瘤A_(375)细胞抑制机制的探讨

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人恶性黑素瘤A375细胞的生长抑制作用,以及对Caspase-3活性表达以及肿瘤细胞凋亡的影响,为临床治疗恶性黑素瘤提供理论和实验依据。方法:将不同浓度的As2O3作用于人恶性黑素瘤A375细胞,荧光染色观察A375细胞的凋亡变化,流式细胞术检测A375细胞的凋亡率;用免疫组织化学染色法检测不同浓度As2O3作用于A375细胞后Caspase-3蛋白的表达;半定量RT-PCR法检测Survivin蛋白的表达。结果:荧光染色后镜下可见As2O3可致A375细胞的细胞核呈致密浓染的不规则黄绿色颗粒状或块状荧光的凋亡现象;As2O3能诱导A375细胞的凋亡,用5、10、20μmol/L的As2O3诱导A375细胞24 h:检测其细胞的凋亡率依次为7.07%、38.66%和4.34%,可诱导Caspase-3蛋白的表达,抑制Survivin蛋白的表达。结论:As2O3能致A375细胞形态改变,诱导细胞凋亡;As2O3可诱导A375细胞表达Caspase-3蛋白,抑制Survivin蛋白的表达。

低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响

目的探讨低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响。方法对恶性黑色素瘤A375细胞进行体外培养,细胞分为空白对照组、CoCl_(2)组、SB-431542阻断组和CoCl_(2)+SB-431542组,以氯化钴(CoCl_(2))诱导构建A375细胞内的低氧环境,SB-431542阻断Nodal信号通路,应用Western Blot技术检测以上不同环境下A375细胞内Nodal、类激活素激酶(ALK7)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和波形蛋白(Vimentin)的表达。结果不同浓度的SB-431542阻断A375细胞Nodal信号通路后细胞形态无明显改变,以上不同浓度阻断24 h、48 h、72 h时A375细胞增殖活力比较差异有统计学意义(P<0.05),随着时间增加细胞活力明显增强,但是随着浓度增高,细胞活力随之下降,SB-431542对A375细胞增殖的阻断具有剂量和时间依赖性;各组Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),CoCl_(2)组A375细胞内Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表达均较空白对照组上调(P<0.05),与CoCl_(2)组比较SB-431542阻断组、CoCl_(2)+SB-431542组表现为以上蛋白表达下调(P<0.05)。结论低氧环境可诱导恶性黑色素瘤A375细胞中Nodal及MMP2和Vimentin的表达上调,这可能与A375细胞的迁移和侵袭恶化有关,同时通过SB-431542可阻断细胞增殖的Nodal信号通路。

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P<0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。

色象中药对人A375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

目的:研究黑白两类中药水提取物对人A 375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性调节的影响。方法:采用多巴速率氧化法研究中药对酪氨酸酶活性调节的影响。结果:研究发现,与对照组相比,黑色组中药大部分对酪氨酸酶活性有明显促进作用(P<0.05或P<0.01),而白色组大部分则有明显抑制作用(P<0.05或P<0.01)。另外,研究发现白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、当归具有双向调节作用,而桃仁虽为白色,但却起着促进作用。结论:黑色或深色类药物促进酪氨酸酶活性的作用更明显,而白色或浅色类药物的抑制作用更明显。说明药材颜色与色素代谢调节存在一定的相关性,在色素代谢障碍性皮肤病的临床治疗中值得借鉴应用。

栀子苷、黄芩苷、华蟾酥毒基对体外培养的B16恶性黑素瘤细胞细胞增殖的抑制作用

目的观察栀子苷、黄芩苷、吴茱萸内酯、穿心莲内酯、华蟾酥毒基等5种中药单体成分抗恶性黑素瘤的活性。方法以系列浓度的上述5种药物作用体外培养的B16恶性黑素瘤细胞72h,顺铂为对照,MTT法测定细胞增殖抑制率。结果在5种中药单体中,栀子苷、黄芩苷、华蟾酥毒基对体外培养的B16恶性黑素瘤细胞增殖有抑制作用。其中栀子苷对细胞增殖的抑制率呈量效关系,最大抑制率达62.9%;黄芩苷仅在最高浓度时(80μg/mL)对细胞增殖有抑制作用,抑制率为42.8%;华蟾酥毒基浓度≥20μg/mL时表现出对细胞增殖的抑制作用,但无明显量效关系,最大抑制率仅为24.1%(40μg/mL);80μg/mL的栀子苷对细胞增殖的抑制作用与2μg/mL的顺铂无明显差异;穿心莲内酯、吴茱萸内酯则对细胞增殖无明显影响。结论栀子苷、黄芩苷、华蟾酥毒基具有抗恶性黑素瘤的作用,可以做为治疗恶性黑素瘤的备选药物。

补骨脂注射液联合NB-UVB对人黑素瘤A375细胞增殖及黑素合成的影响

目的通过观察补骨脂注射液联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)对人黑素瘤A375细胞的增殖、黑素的合成以及酪氨酸酶活性的影响,探讨两者协同治疗白癜风的可能机制。方法选择一定浓度的补骨脂注射液(稀释后浓度为0.5%)联合一定剂量的NB-UVB(22m J/cm2)共同作用于人黑素瘤A375细胞后,通过MTT法观察其对人黑素瘤A375细胞细胞增殖的影响,Na OH裂解法测定黑素的含量,多巴氧化法测定酪氨酸酶活性的变化。结果补骨脂注射液+NB-UVB组中A375细胞培养至48h,72h后检测到的细胞增殖情况与单一补骨脂注射液组、NB-UVB组及空白组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。补骨脂注射液+NB-UVB组均显示可上调细胞内酪氨酸酶的活性及黑素的生成量,且与各实验干预组及空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论一定浓度的补骨脂注射液(稀释后浓度为0.5%)联合一定剂量的NB-UVB(22m J/cm2)可以协同促进人黑素瘤A375细胞的增殖,上调细胞酪氨酸酶活性,从而达到促进黑素合成的效果。

沉默ERK增强A375黑素瘤细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性

目的：探讨直接抑制细胞外信号调节激酶（extra cellular signal-regulated kinase,ERK）表达后,对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL）对黑素瘤细胞杀伤作用的影响及其作用机制。方法：用携带ERK特异或对照shRNA的慢病毒感染A375黑素瘤细胞,48 h后加入终浓度为100μg/ml基因重组TRAIL蛋白继续培养6h,收获细胞,碘化丙啶染色,用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和TRAIL受体的表达;Western blotting检测相关蛋白的表达水平。结果：亚型特异的ERK shRNA分别沉默ERK1或ERK2,导致A375细胞出现G_1期阻滞（对照shRNA组的G_1期细胞比例为71%,ERK1、ERK2、ERK1＋2 shRNA组分别增加到85%、90%和81%,P〈0.01）;S期细胞从对照组的11%减少到2%左右（P〈0.001）、G_2/M期细胞也从对照组的17%减少到3%（P〈0.01）。细胞周期改变伴有P21、P27蛋白上调和Cyclin D1蛋白降低,但未见明显的细胞凋亡。经对照shRNA和TRAIL处理的细胞,仅有15%的凋亡率,而ERK shRNA和TRAIL联合处理则使凋亡率达到40%~60%（P〈0.01）。抑制ERK蛋白表达能显著上调细胞表面TRAIL受体DR4的表达（从对照组32%增加到75%~80%,P〈0.01）,但DR5变化不明显。ERK抑制还明显降低A375细胞的葡萄糖转运受体1（Glut 1）和己糖激酶Ⅱ（HK-Ⅱ）的蛋白表达水平。结论：直接抑制ERK不仅可以抑制肿瘤细胞周期的进展,而且可以增强TRAIL对A375黑素瘤细胞的杀伤作用,其机制与上调细胞表面DR4的表达和干扰肿瘤细胞糖代谢有关。

一氧化氮在血管内皮生长因子诱导恶性黑素瘤细胞增殖机制中的研究

目的 观察血管内皮生长因子 (VEGF)过度表达对恶性黑素瘤细胞株A3 75增殖的影响 ,研究一氧化氮在其中所起的作用 ,以明确VEGF的作用机制。方法 VEGF165cDNA经电穿孔转染A3 75细胞 ,经逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、免疫酶联吸附实验 (ELISA)检测转染前后A3 75细胞VEGF的mRNA和蛋白表达 ,应用细胞计数和MTT法比较转染组和对照组A3 75细胞增殖能力和活性 ,用硝酸还原酶法检测A3 75细胞转染前后培养上清中一氧化氮含量 ,并应用一氧化氮合酶抑制剂N 硝基 L 精氨酸甲酯 (L NAME)观察A3 75细胞转染VEGF165cDNA后的增殖情况。结果 转染VEGF165cDNA后 48h、72h和 96hA3 75细胞VEGFmRNA分别为 0 .48± 0 .0 5 ,1.2 7± 0 .0 7,1.2 4± 0 .0 1,较转染前的 0 .2 4± 0 .0 5明显增加 (P <0 .0 5 ) ;VEGF蛋白表达和一氧化氮水平也呈相同的变化趋势 (P <0 .0 5 ) ;转染VEGF165cDNA后A3 75细胞增殖能力较未转染组明显增强 (P <0 .0 5 ) ;L NAME可剂量依赖性地抑制转染后的A3 75细胞增殖活性 (P <0 .0 1)。结论 内源性的一氧化氮在VEGF促进A3 75细胞增殖中起重要作用。

蒺藜皂苷对人黑素瘤A375细胞增值、粘附及黑素合成的作用

目的观察不同浓度的蒺藜皂苷对人黑素瘤A375细胞增值、粘附及黑素合成的作用.方法：选取人黑素瘤A375细胞为细胞模型,并以蒺藜皂苷进行干预,采用CCK-8法测定细胞活力,粘附实验测定细胞粘附力,氢氧化钠法测黑素含量,流式细胞术测ICAM-1含量.结果：不同浓度的蒺藜皂苷处理后,其细胞活力、细胞粘附力、黑素含量均有所增加,ICAM-1含量降低,其中以100、200 ug/mL效果好.结论：蒺藜皂苷能够促进人黑素瘤A375细胞增值、粘附及黑素合成,从而对白癜风患者发挥一定的治疗作用.

嵌合型抗原受体T细胞在恶性黑色素瘤中应用进展

恶性黑素瘤细胞膜表达有多种生物标志物,可作为治疗靶点开发针对性的嵌合型抗原受体T细胞(CAR-T),CAR-T目前对恶性黑素瘤中GD2、HER2、CD70、Gp100、NYESO-1等靶点已表现出良好的疗效。本文旨在梳理恶性黑素瘤CAR-T靶点及临床进展,分析工程化T细胞的挑战与应对之策,以期CAR-T应用于恶性黑素瘤临床实践。

芍药苷对人黑素瘤细胞株A375增殖凋亡的影响

目的:研究不同浓度芍药苷(PF)对人黑素瘤细胞A375增殖抑制及早期凋亡的影响。方法:将体外培养的人黑素瘤细胞株A375分为6组,5个实验组分别加入不同浓度PF(2、1、0.5、0.1、0.01 mg/mL),对照组不加PF。光镜下观察细胞密度及形态、MTT法测定细胞增殖抑制率,Annexin V/PI染色法检测细胞早期凋亡率。结果:镜下观察可见随着PF浓度的增加,黑素瘤细胞株A375数量降低,贴壁能力渐差,细胞形态渐圆钝,甚至出现皱缩。与对照组相比,不同浓度PF处理A375细胞24 h、48 h和72 h后,PF对细胞有浓度依赖性的增殖抑制作用(P<0.05),但未见明显的时间依赖性(P>0.05)。不同浓度PF干预24 h时A375细胞的早期凋亡率,对照组和各实验组差异无统计学意义(P<0.05)。结论:PF能抑制人黑素瘤细胞株A375的增殖,这种抑制作用呈浓度依赖性而非时间依赖性,但对A375细胞早期凋亡率无明显影响。

磷酸化活化转录因子2和磷酸化细胞信号传导与转录活化因子3在皮肤恶性黑素瘤中的表达

目的:探讨磷酸化活化转录因子(p-ATF)2和磷酸化细胞信号传导与转录活化因子(p-STAT)3在皮肤恶性黑素瘤中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化方法分别检测p-ATF2和p-STAT3在25例原发性皮肤恶性黑素瘤(CMM)患者和14例转移性恶性黑素瘤(转移性MM)患者组织病理切片中的表达水平。结果:p-ATF2和p-STAT3在25例CMM和14例转移性MM患者组织病理切片中细胞表达阳性率均分别显著高于色素痣中的表达阳性率(P<0.01),但在25例CMM和14例转移性MM之间细胞表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。在25例CMM和14例转移性MM患者组织病理切片中,p-ATF2阳性表达与p-STAT3阳性表达均分别有高度相关性(r分别为0.912和0.934,P均<0.01)。结论:p-ATF2和p-STAT3虽在CMM和转移性MM中高表达,但与皮肤恶性黑素瘤的侵袭和转移无明显相关。

氢化可的松对人A375黑素瘤细胞株黑素生成的影响

目的:通过观察不同浓度的氢化可的松对人A375黑素瘤细胞的生长、黑素生成以及酪氨酸酶活性的影响,探讨氢化可的松治疗白癜风的作用机制。方法:用不同浓度的氢化可的松处理人A375黑素瘤细胞,通过MTT比色法观察氢化可的松对人A375黑素瘤细胞生长的影响,用NaOH裂解法测定黑素的含量,用多巴氧化法测定酪氨酸酶活性的变化。结果:氢化可的松在一定浓度范围内促进人A375黑素瘤细胞增殖,酪氨酸酶活性增强,黑素含量增加。结论:一定浓度的氢化可的松可以促进人A375黑素瘤细胞增殖,激活酪氨酸酶活性,促进黑素生成,为探讨氢化可的松治疗白癜风的机制提供了实验依据。

NF-κB抑制剂PDTC对人黑素瘤A375细胞增殖的影响

目的研究核转录因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸(PDTC)对人黑素瘤A375细胞的生长抑制作用。方法不同浓度的PDTC作用于A375细胞不同时间后,MTT法测定其对A375细胞增殖的抑制率,免疫细胞化学方法检测PDTC作用下A375细胞增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,PDTC作用后A375细胞PCNA表达降低(P<0.01),且呈明显的剂量依赖关系。结论 PDTC具有显著抑制人黑素瘤A375细胞生长及PCNA表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。

血管内皮生长因子过度表达促进恶性黑素瘤细胞增殖机制研究

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)过度表达促进恶性黑素瘤(MM)细胞增殖的机制。方法:通过电穿孔法将VEGF165cDNA转染至MM细胞系A375中,细胞计数法、MTT法和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测A375细胞体外增殖效应和其分泌的VEGF蛋白水平,化学比色法和蛋白印迹法(Western Blot)分别检测转染前后的A375细胞合成的诱导型、内皮型、神经型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的活性和蛋白表达。结果:转染VEGF165cDNA后,A375细胞明显增殖,其分泌的VEGF在转染后72 h、96 h明显增加(P<0.01),其合成的iNOS的活性和蛋白表达在转染后48 h、72 h、96 h明显升高(P≤0.05),但在转染前后未检测到eNOS和nNOS的活性及蛋白表达,一氧化氮合酶抑制剂L-NAME呈剂量依赖性地抑制转染72 h后的A375细胞增殖活性。结论:iNOS可能在VEGF过度表达促进MM细胞增殖中发挥重要作用。