质子辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞的DNA损伤影响研究

为研究质子辐射对人恶性黑色素瘤的杀伤效应,本研究利用北京HI-13串列加速器提供的15 MeV质子,以0、1、2、4、8 Gy剂量辐照A375细胞,以细胞克隆术和流式细胞术检测A375细胞的克隆形成率、周期阻滞及凋亡率,用免疫荧光法检测2 Gy辐照后细胞的γH2AX焦点数,并与相同条件下的γ射线辐射对比。结果表明,在1~8 Gy剂量下,随着剂量的增加,A375细胞的存活率下降,在4~8 Gy剂量下,细胞的存活率明显低于γ射线。辐照后12 h,细胞G2/M期阻滞随剂量的增加而增加,质子辐射诱导的周期阻滞强于γ射线;辐照后48 h,γ射线诱导的细胞周期阻滞已基本解除,但质子诱导的细胞周期阻滞除1 Gy外,2~8 Gy均未完全解除。辐射诱导的细胞凋亡随照射剂量的增加而增加,随着时间的延长,凋亡比例有所增加,且质子诱导的细胞凋亡率高于γ射线。辐照2 Gy后,γ射线和质子诱导的γH2AX焦点峰值均在照后1 h出现,质子辐射诱导的γH2AX焦点数和大小均高于γ射线。以上结果表明,质子辐射可有效杀伤恶性黑色素瘤A375细胞,在黑色素瘤治疗中有潜在应用价值。

纳秒脉冲电场治疗裸鼠皮下人恶性黑色素瘤模型的长期效应

为研究ns脉冲电场(nsPEF)对在体肿瘤的长期杀伤效应,以接种人恶性黑色素瘤A375细胞的BALB/c裸鼠为研究对象,采用电压幅值为4kV、脉冲宽度为200ns、重复频率为1Hz的ns脉冲电场进行治疗。肉眼观察结果表明,瘤体随时间推移而逐渐消褪直至消失,且皮肤恢复完好,原位瘤在平均2周时间内完全消失;瘤体生长抑制情况检测结果表明,与对照组相比,治疗组裸鼠肿瘤体积明显缩小(检验水准P<0.05),随着生存时间延长,对照组和治疗组肿瘤生长速度差别增大;荷瘤裸鼠的存活率-时间关系研究结果表明,ns脉冲电场治疗后26d时间内,对照组裸鼠全部死亡,而治疗组裸鼠存活率高达100%。实验结果表明ns脉冲电场能有效抑制肿瘤组织的生长,并可大大提高荷瘤BALB/c裸鼠的长期存活率。

马钱苷抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用及机制研究

目的探索马钱苷抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用和机制。方法将实验分为空白对照组、不同干预浓度(10、20、40、60、80 ng/m L)的马钱苷组,分别作用24、48、72 h,采用MTT方法检测细胞活性;依据药物作用48 h时的IC50浓度[(74.96±7.92)ng/m L],选取马钱苷20、40、60 ng/m L分别干预48 h,并采用RT-PCR法检测细胞内Bcl-2、Bax和Caspase-3 m RNA表达水平的变化;用Western blot检测细胞内Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的变化。结果马钱苷具有抑制A375细胞增殖的作用,并呈时间和剂量依赖性。与空白对照组比较,马钱苷组细胞抑制凋亡因子Bcl-2的m RNA和蛋白质表达水平均明显下调(P<0.05或P<0.01),促凋亡因子Bax和Caspase-3的m RNA及蛋白质表达均明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论马钱苷能抑制A375细胞增殖,其作用机制可能与下调细胞Bcl-2 m RNA与蛋白质的表达,上调Bax、Caspase-3 m RNA和蛋白质的表达,进而诱导细胞凋亡有关。

紫菜多酚对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和诱导凋亡的影响及机制探讨

以紫菜为原料,通过乙醇溶剂提取、硅胶柱层析、高效液相制备色谱等步骤,得到紫菜多酚组分C1、C2、D1、D2四个组分.通过MTT法测定组分C1、C2对人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖抑制作用,结果表明:组分C1、C2作用于A375细胞48 h的IC50分别为1.10、1.58 mg·m L-1.采用Annexin V/PI双染测定细胞凋亡情况发现,A375细胞经紫菜多酚组分C1处理后凋亡的细胞比例增加.经组分C1作用的A375细胞中黑色素含量和相对酪氨酸酶活力均得到提高,且与药物浓度呈正相关关系;透射电镜检测A375细胞超微结构的变化发现紫菜多酚组分C1可诱导A375细胞趋向正常分化.

腺病毒介导的nm23-H1对人恶性黑色素瘤A375体外抑制作用的研究

目的观察Ad-GFP-nm23-Hl抑制人恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)A375细胞生长和转移的作用,为后期nm23-Hl基因和腺病毒载体用于MM及其它肿瘤的基因治疗提供一定的理论和方法。方法采用MTT法检测Ad-GFP-nm23-Hl,对A375细胞增殖力的影响,用细胞基质胶黏附实验黏附力和侵袭能力实验来分别检测Ad-GFP-nm23-Hl,对A375细胞粘附力和侵袭能力的影响。结果Ad-GFP-nm23-Hl可以明显抑制A375细胞的增殖、黏附和侵袭能力,其抑制作用呈剂量—效应关系。结论Ad-GFP-nm23-Hl,对人恶性黑色素瘤A375细胞的生长和转移具有抑制作用。

银杏叶多糖对人恶性黑色素瘤细胞增殖的影响

研究了银杏叶多糖(PGBL)对人恶性黑色素瘤(A375)细胞增殖的影响。采用50μg.ml-1、100μg.ml-1和200μg.ml-1浓度的PGBL作用于A375细胞,MTT法检测细胞生长和增殖情况。结果表明,不同浓度的PGBL都可抑制A375细胞的增殖,且呈浓度、时间依赖性。证明PGBL对恶性黑色素瘤有一定的防治作用。

莫诺苷对人恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的调控机制

目的:探究莫诺苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖及凋亡的影响及作用机制。方法:将莫诺苷作用于A375细胞,采用MTT法测定细胞活力,Annexin-FITC/PI双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western印迹检测细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果:与空白对照组比较,顺铂阳性药和高中低浓度莫诺苷均能明显抑制细胞增殖(P<0.01),明显下调周期蛋白D1和凋亡因子Bcl-2的表达水平(P<0.01或P<0.05),明显上调P21和促凋亡因子Bax的表达水平(P<0.01)。结论:莫诺苷能抑制人恶性黑色素瘤细胞增殖和促进其凋亡,其机制可能是通过下调周期蛋白D1和Bcl-2蛋白的表达水平,上调P21和Bax蛋白的表达水平,调控周期蛋白D1-CDK-P21通路及凋亡通路,从而促进恶性黑色素细胞的凋亡。

Ad-GFP-nm23-H1裸鼠体内抑制人恶性黑色素瘤A375作用的研究

目的探讨Ad-GFP-nm23-H1对人恶性黑素瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,从而为后期nm23-Hl基因和腺病毒载体用于人恶性黑色素瘤及其它肿瘤的基因治疗提供一定的理论和方法。方法在裸鼠真皮下建立人A375细胞黑色素瘤动物模型后,设对照组及109PFU/ml、1010PFU/ml的Ad-GFP-nm23-Hl干预组。经Ad-GFP-nm23-Hl干预治疗后,取瘤体称重,计算抑瘤率,通过光镜进行瘤组织病理形态学观察。结果对照组及109PFU/ml、1010PFU/ml的Ad-GFP-nm23-Hl干预组的平均肿瘤体积和瘤重分别为:1.4129±0.4832mm3、1.1914±0.3304mm3、0.75±0.2548mm3和1.924±0.539g、1.655±0.5754g、1.195±0.2639g。与另两组比较,1010PFU/ml的Ad-GFP-nm23-Hl干预组对A375具有明显的抑制作用。结论1010PFU/ml的Ad-GFP-nm23-Hl干预组对裸鼠移植A375实体瘤有明显的抑制作用。

MTH1抑制剂TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖与迁移的影响

目的探讨MTH1抑制剂TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、迁移的影响。方法利用细胞培养手段培养人恶性黑色素瘤A375细胞;应用倒置显微镜法观察TH588对细胞形态的影响;采用CCK-8法检测不同浓度TH588(0、4、8、16、32、64μmol/L)对A375细胞的增殖抑制作用;采用集落克隆形成抑制试验观察对比高中低三种浓度(12.8、6.4、3.2μmol/L)TH588对A375细胞的增殖抑制作用;细胞划痕实验检验TH588对A375细胞迁移能力的影响。结果CCK-8检测结果显示,同一时间段不同浓度TH588组与空白对照组比较,细胞存活率均降低;32、64μmol/L TH588浓度下培养48、72 h时细胞存活率均低于同TH588浓度下培养24 h时。倒置显微镜法观察TH588作用于人恶性黑色素瘤A375细胞后,细胞明显皱缩,且边缘变得模糊,有碎片颗粒产生。集落克隆形成抑制实验表明,TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖有明显抑制作用。细胞划痕实验表明,经TH588作用后A375细胞划痕迁移距离在48 h内均较无干预的A375细胞迁移距离更短。结论TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖及迁移有明显抑制作用,且低浓度的TH588便有较好的抑制效果。

人恶性黑色素瘤多发转移裸鼠动物模型的建立

目的探讨建立人恶性黑色素瘤多发转移裸鼠动物模型的方法,为进一步研究恶性黑色素瘤的发病机制提供动物模型。方法将MV3人黑色素瘤细胞注射于裸鼠背部皮下,待裸鼠背部皮下出现肿瘤后,通过病理学检查及免疫组化技术对动物模型进行鉴定。结果裸鼠皮下接种人黑色素瘤细胞28d后背部皮下相继出现肿瘤,肿瘤组织免疫组化结果显示S-100及HMB45阳性,肿瘤组织HE染色及肺、脾、肝、脑、肾各组织免疫组化结果显示各组织均出现不同程度转移灶,表明成功建立人黑色素瘤多发转移裸鼠模型。结论该研究选择来源于人的恶性黑色素瘤细胞MV3接种于裸鼠背部皮下,28d后成功建立了人黑色素瘤多发转移裸鼠动物模型,该模型为进一步研究黑色素瘤的生物学特性及新药开发提供了实验依据。

黄芪注射液影响人恶性黑色素瘤细胞增殖和迁移的实验研究

目的:探讨黄芪注射液对人恶性黑色素瘤A375细胞生长、增殖、细胞周期和迁移的影响。方法:利用细胞培养技术对恶性黑色素瘤A375细胞进行培养,光学显微镜下观察黄芪注射液对A375细胞形态的影响;利用MTT法比较实验组和对照组A375细胞的生长抑制率,研究黄芪注射液对A375细胞生长增殖的影响;利用流式细胞术和细胞划痕实验检测黄芪注射液对黑色素瘤A375细胞周期和迁移的影响。结果:光学显微镜下观察发现,与对照组相比,不同剂量的黄芪注射液在处理细胞72h后均影响黑色素瘤A375细胞的形态,细胞死亡增加,且呈质量浓度依赖性;MTT结果显示,黄芪注射液对A375细胞生长抑制作用明显,且抑制率呈时间和剂量依赖性。流式细胞术和划痕实验结果显示,黄芪注射液可以使A375细胞的细胞周期各个时相发生改变,其中G2期和S期的细胞百分数明显增加,且呈剂量依赖性的;影响A375细胞划痕的愈合。结论:黄芪注射液可以有效地抑制A375细胞的生长和增殖,可以将A375细胞阻滞在G2/M期,有效的阻滞了细胞的分裂进程,导致细胞死亡。同时发现一定浓度的黄芪注射液可抑制A375细胞的迁移运动,有利于黑色素瘤患者的预后。

文冠果壳苷诱导人恶性黑色素瘤A375.S2细胞的凋亡及机制

目的观察文冠果壳苷对人恶性黑色素瘤A375.S2细胞增殖抑制作用及诱导凋亡的机理。方法采用四甲基噻唑蓝法(MTT法)检测化合物对细胞的生长抑制作用,光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态学变化,免疫印迹法(Western blotting)检测p-p38、p38、核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65及核转录抑制因子-κB(nuclear factor kappa B inhibitor,I-κB)蛋白表达水平,检测细胞核内NF-κB p65表达水平。结果文冠果壳苷可浓度依赖性地抑制A375.S2细胞增殖,并优于5-氟尿嘧啶(5-FU);10μmol·L-1文冠果壳苷作用于A375.S2细胞,形态学观察发现明显的凋亡小体和核固缩;Western blotting检测发现文冠果壳苷可时间依赖性地降低p-p38、p38、NF-κB p65及I-κB的蛋白表达水平;文冠果壳苷抑制NF-κB p65自细胞浆到细胞核的转位。结论文冠果壳苷可能通过抑制NF-κB和p38的活化诱导人恶性黑色素瘤A375.S2细胞凋亡。

Monascin对人恶性黑色素瘤细胞A375的诱导分化作用

研究红曲代谢产物Monascin对人恶性黑色素瘤细胞A375的诱导分化作用。用MTT法评价Monascin对A375增殖的抑制作用;PI流式单染检测细胞周期分布;透射电镜观察细胞超微结构变化;以黑色素含量、酪氨酸酶活力和体外迁移能力为指标检验Monascin对A375诱导分化作用。Monascin对A375具有一定的增殖抑制作用,并能将其阻滞在G0/G1期;透射电镜观察到A375核质比变小且细胞器增多;黑色素含量增多,相对酪氨酸酶活力提高,体外迁移能力下降。试验结果表明,Monascin对A375具有较显著的诱导分化作用。

芍药苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖的体外抑制作用及其机制研究

目的探讨芍药苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖的体外抑制作用及其作用机制。方法不同浓度芍药苷(3、10、30μmol/L)作用于黑色素瘤细胞A375,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期情况,Western blotting法检测NFκB p65信号通路激活情况及下游靶分子Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表达。结果与对照组比较,随着给药浓度的增加,芍药苷对黑色素瘤细胞A375抑制作用逐渐增强,30μmol/L作用48 h时抑制作用最高,并使A375细胞周期阻滞在G1期;芍药苷显著抑制NFκB p65、IκBα的磷酸化,下调Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表达,上调Bax表达,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论芍药苷能抑制人黑色素瘤细胞A375体外增殖,可能是通过NF-κB信号通路发挥作用的。

鸦胆子苦醇联合长波紫外线辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的影响研究

目的观察鸦胆子苦醇联合长波紫外线(UVA)辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制。方法人恶性黑色素瘤A375细胞分为空白组、对照组和实验组。空白组细胞不做任何处理,对照组用75 k J·m^(-2)长波紫外线处理,实验组在75 k J·m^(-2)长波紫外线处理2 h后分别加入10,20,50,100,200nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇。检测各组细胞活性、细胞周期及凋亡率,检测人转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)通路及线粒体凋亡途径相关蛋白表达情况。结果对照组和实验组细胞活性均显著低于空白组,50,100,200 nmol·L^(-1)实验组细胞活性均显著低于对照组,且随鸦胆子苦醇作用浓度增大而逐渐降低(P<0.05或P<0.01)。对照组和10,20,50,100,200 nmol·L^(-1)实验组细胞凋亡率分别为(3.21±0.24)%,(3.45±0.26)%,(5.86±0.42)%,(12.62±1.12)%,(13.02±2.24)%,(16.15±2.78)%,均显著高于空白组的(0.89±0.12)%,20,50,100,200 nmol·L^(-1)实验组细胞凋亡率均明显高于对照组(均P<0.01)。对照组和实验组与空白组比较,人恶性黑色素瘤A375细胞G0/G1期细胞比例逐渐升高,G2/M和S期细胞比例逐渐降低(P<0.05或P<0.01)。空白组、对照组和50 nmol·L^(-1)实验组Nrf2蛋白相对表达量分别为1.69±0.23,1.23±0.24,1.03±0.15,谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)蛋白相对表达量分别为2.43±0.16,2.89±0.18,2.78±0.21,B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达量分别为0.59±0.14,1.05±0.21,1.59±0.24,胱天蛋白酶-3(caspase-3)蛋白相对表达量分别为2.63±0.15,2.71±0.26,2.63±0.28。与空白组比较,对照组和实验组人恶性黑色素瘤A375细胞Nrf2蛋白表达相对量降低,Bax和GSTP1蛋白表达相对量升高,caspase-3无明显变化。结论鸦胆子苦醇联合UVA辐射可抑制人恶性黑色素瘤A375细胞增殖,且存在一定的量效关系,与抑制Nrf2信号通路及激活线粒体凋亡途径相关蛋白,加速细胞凋亡有关。

RNA干扰硒蛋白V基因对人恶性黑色素瘤细胞A375生物学行为的影响（英文）

目的体外观察sh RNA靶向干扰硒蛋白V(SELV)基因对人恶性黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法构建以SELV为靶基因的sh RNA表达载体,将其转染至体外培养的A375细胞中,并利用嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。采用实时荧光定量反转录PCR(q RT-PCR)和Western blotting法分别检测转染细胞SELV的m RNA和蛋白表达水平;采用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,并利用流式细胞术检测转染细胞的细胞周期和早期凋亡率。采用q RT-PCR和ELISA法对转染细胞的SELV功能相关因子含锚蛋白重复序列-细胞因子信号抑制物盒蛋白家族9(ASB9)和O-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)的表达情况进行检测。结果成功构建靶向SELV的sh RNA重组质粒,并获得稳定转染的A375细胞。转染后SELV的表达显著降低(P<0.05),细胞增殖和细胞周期未发生明显变化,但细胞早期凋亡率显著增加(P<0.05)。而转染细胞的ASB9和OGT表达量也明显增加(P<0.05)。结论靶向SELV的sh RNA重组质粒能够下调SELV在A375细胞中的表达,提高细胞早期凋亡率,并导致ASB9和OGT的表达升高。

多酚氧化酶抑制剂高良姜素抗黑色素瘤机制研究

目的:研究高良姜素对多酚氧化酶(PPO)的抑制作用机制,并探讨了高良姜素与多酚氧化酶的结合机制,以期获得高良姜素抗人恶性黑色素瘤细胞株A375机理。方法:分光光度法检测高良姜素对PPO的抑制作用和抑制作用类型;荧光光谱法和分子对接法检测高良姜素与PPO酶的结合方式;MTT法测定高良姜素人恶性黑色素瘤细胞株A375增殖的抑制作用,Transwell法检测高良姜素对A375细胞侵袭的抑制作用。结果:高良姜素是一种竞争型的PPO抑制剂,对PPO氧化酶的半抑制率IC_(50)为(47.86±3.33)μmol/L,抑制常数Ki为(24.83±1.45)μmol/L;高良姜素能够有效猝灭PPO的荧光,高良姜素与PPO的结合常数Ka为(4.67±0.43)×10~4L/mol;高良姜素能够与PPO的活性中心铜离子发生结合作用,并与催化基团His259形成氢键;高良姜素能够明显的抑制A375细胞的增殖和转移,且细胞中的PPO活性和黑色素的合成量降低。结论:高良姜素是一个竞争性的PPO酶抑制剂,对调节黑色素水平起到重要作用,为临床抗皮肤癌提供了理论基础。

肿瘤细胞分泌的VEGF-C和CCR7在恶黑淋巴道转移中的作用

目的研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)和C-C家族趋化因子受体7(CCR7)与恶性黑色素瘤(恶黑)淋巴管浸润、淋巴结转移的关系及其预后价值。方法免疫组化方法检测56例恶黑组织中VEGF-C和CCR7的表达,淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(LYVE-1)标记肿瘤的淋巴管,Kaplan-Meier法进行生存检验,应用Cox比例危险度模型筛选与恶黑预后有关的指标。结果肿瘤细胞胞浆中可检测到VEGF-C和CCR7的表达。CCR7表达与VEGF-C表达和淋巴管浸润有关,CCR7和VEGF-C协同增加淋巴管浸润,CCR7表达与淋巴结转移及预后无关。结论在恶黑组织中VEGF-C和CCR7诱导肿瘤细胞侵入到淋巴管,但CCR7和淋巴管浸润不能作为恶黑的预后指标。

基于Bcl-2蛋白P2、P3活性区域抑制剂的设计、合成及体外活性研究

目的探索Bcl-2蛋白P2、P3活性区域的构效关系,并设计合成活性较好的抑制剂。方法基于对Bcl-2蛋白抑制剂、Bcl-2蛋白P2、P3活性区域的分析,利用Autodock 4.2软件设计对接,合成一系列新型Bcl-2小分子抑制剂;采用MTT法测定所合成的抑制剂对人恶性黑色素瘤细胞A375、人肝癌细胞Hep G-2、人非小细胞肺癌细胞A549的体外抗肿瘤活性。结果合成了13个新型Bcl-2小分子抑制剂(D1~D13),其中,化合物D2、D6、D8的活性相对较好,对人恶性黑色素瘤细胞A375的抑制作用与阳性对照紫杉醇相当;化合物D1、D3、D4、D5也对A375细胞具一定的抑制活性。结论获得了P2、P3活性区域的构效关系,有助于Bcl-2蛋白抑制剂的进一步研究。