人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆

目的:克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因。方法:采用RT-PCR方法,从人成牙本质样细胞系中克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基的特异性基因片段,将其亚克隆入pUC18载体进行序列测定。结果:从人成牙本质样细胞系中获得900bp的特异性片段。序列分析表明,与Gen-Bank登陆的人L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列完全一致。结论:成功地从人成牙本质样细胞系中克隆到人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列。

人成牙本质细胞L型钙离子通道特异性基因片段的克隆研究

目的:克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段。方法:选取新鲜拔除的健康恒牙,利用牙科专用慢速切锯制备牙齿切片,采用酶消化法分离出完整的人成牙本质细胞,利用RT-PCR技术直接从人成牙本质细胞中克隆L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因片段,将其亚克隆入pGM-T载体进行序列测定。结果:从人成牙本质细胞中获得452bp的特异性片段。序列分析表明,其与Gen-Bank中已登录的人L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因序列一致。结论:成功地从人成牙本质细胞中克隆到人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因序列片段。

人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因原核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因原核表达质粒。方法:采用RT-PCR技术从人成牙本质样细胞系中获得cDNA,将该基因插入原核表达载体pProEXHTb中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌DH5α,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定,同时对阳性克隆进行测序鉴定。结果:获得的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性cDNA序列,与GenBank登录的cDNA序列一致。结论:成功地构建了人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因原核表达质粒。

人成牙本质细胞的分离和鉴定

目的:分离并鉴定完整的成熟人成牙本质细胞。方法:收集人健康恒牙,采用胶原酶和蛋白酶联合消化法分离出成牙本质细胞,并对分离出的细胞进行细胞形态学和免疫组织化学鉴定。结果:实验分离出的细胞为柱状或立方状,有较长的细胞突起,具有典型的成牙本质细胞形态,免疫组化染色显示细胞表达Ⅰ型胶原、DMP1和DSP蛋白。结论:本研究分离得到了完整的成熟人成牙本质细胞,为后期研究成牙本质细胞的分化、功能及特点奠定基础。

人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因的克隆、原核表达和纯化

目的:获得原核表达的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性蛋白。方法:采用RT-PCR技术从人成牙本质样细胞系中获得cDNA,亚克隆至PUC18载体中,经测序确认后,将该基因插入原核表达载体pProEXHTb中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌DH5α,以IPTG诱导蛋白表达,并经Ni-NTA亲和柱层析纯化,SDS-PAGE鉴定。结果:获得的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列一致。结论:成功克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因,建立了原核表达、纯化体系,制备了纯化的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性蛋白。

TNF-α调控HODs样细胞瞬时感受器电位TRVP2通道蛋白表达的初步研究

目的分析肿瘤坏死因子α(TNF-α)调控人成牙本质细胞(HODs)样细胞中瞬时感受器电位香草酸受体2(TRPV2)离子通道的表达特征和相关受体,进一步丰富对人牙髓TRPV2离子通道生理功能研究的认识。方法收集2016年9月—2017年1月在天津医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸拔除的健康完整第三磨牙20颗,患者年龄18~25岁。获取牙髓组织,在含10%胎牛血清的培养基中孵育、诱导和传代,选取第4~6代细胞进行后续实验。免疫荧光染色检测诱导HODs样细胞标志性蛋白特异性抗体牙本质涎磷蛋白(DSPP)和nestin表达特征,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(WB)和流式细胞术(FCM)等方法分别检测0、1、10μg/L TNF-α对TRPV2离子通道表达水平的影响。使用肿瘤坏死因子受体(TNFR)1拮抗剂R-7050处理细胞,分析TNFR1在TNF-α调控TRPV2离子通道表达中的作用。结果免疫荧光染色鉴定HODs样细胞DSPP和nestin表达阳性,RT-qPCR和WB证实,与无TNF-α处理的对照组相比,10μg/L TNF-α能够明显上调TRPV2离子通道mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),FCM也发现TNF-α能够提高TRPV2蛋白表达水平。研究进一步证实,与未用R-7050处理的阴性对照组相比,使用R-7050后TNF-α诱导的HODs样细胞TRPV2离子通道表达水平明显下调(P<0.05)。结论TNF-α主要通过TNFR1调控HODs样细胞TRPV2离子通道表达水平上升。

人牙齿切片器官培养模型的建立

目的建立人牙齿切片体外器官培养模型。方法收集年轻人健康前磨牙或第三磨牙,用慢速切锯制备2mm厚的牙齿横切片,将切片用含1%琼脂糖的半固体培养基包被后采用Trowel器官培养方法在体外培养2～14天,对培养切片的细胞及组织形态进行组织学观察。结果实验成功的将牙齿切片在体外培养了两周,成牙本质细胞在培养一周之内能够很好的维持原来的形态。一周之后成牙本质细胞逐渐萎缩,细胞密度减小。结论实验成功的建立了人牙齿切片体外器官培养的模型,为后期进行组织损伤和修复、第三期牙本质的形成等方面的研究奠定了基础。