苦参碱对人成纤维样滑膜细胞生长的影响

目的探讨苦参碱对类风湿关节炎的潜在治疗作用。方法原代培养人关节成纤维样滑膜细胞,传至第3-5代时,以0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL等不同浓度的苦参碱处理细胞,分别于作用后24、48h用倒置显微镜观察细胞形态。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度苦参碱处理的细胞生长情况,计算抑制率。结果不同浓度的苦参碱均可抑制人成纤维样滑膜细胞生长,MTT检测结果显示细胞抑制率为2.52%-25.74%,随苦参碱药物浓度增加和处理时间延长,抑制作用增强。结论苦参碱可抑制人成纤维样滑膜细胞生长,可作为治疗类风湿关节炎的潜在药物。

人成纤维样滑膜细胞冻存时间对其活性的影响

目的探讨适合人成纤维样滑膜细胞(FLS)低温冷藏保存的最佳冻存时间。方法将FLS经-80℃冰箱冷冻保存。在冷冻后2、3、4、5wk分别复苏,培养。观察FLS的生长情况和细胞存活率及24h贴壁率。结果冻存5wk的FLS细胞存活率(66±1.3)%,较冻存2wk(90±2.0)%有明显下降;冻存5wk的FLS24h贴壁率(61.3±2)%,与冻存2wk(85.9±3)%比较有明显下降;未冻存和冻存2wk复苏后FLS的增殖能力无明显差异。结论FLS可以进行低温冷冻,冻存时间4wk为宜。

Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞的表达与功能研究

目的探讨Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞的表达特征及其功能。方法采用RT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞(RA FLS)的表达;采用ELISA方法,检测IgA对RA FLS分泌IL-6的影响。结果采用RT-PCR和免疫荧光染色方法,均检测到Fcα受体在RA FLS的表达。sIgA与RAFLS孵育12h后,细胞分泌IL-6的水平明显增高,差异具有显著性(P<0.01)。mIgA与RA FLS孵育12h后,细胞分泌IL-6的量无明显改变(P>0.05)。sIgA+TNF-α同时与RA FLS孵育12h后,细胞分泌IL-6含量明显高于sIgA或TNF-α单一组(P<0.01)。结论 Fcα受体在类风湿性关节炎人成纤维样滑膜细胞存在表达,sIgA增高RA FLS分泌IL-6的水平,并与TNF-α产生协同作用。

黄芩苷对人成纤维细胞样滑膜细胞(类风湿关节炎)的影响研究

目的探讨黄芩苷对人成纤维细胞样滑膜细胞(类风湿关节炎)(HFLS-RA)分泌IL-1β、TNF-a水平和NF-κB信号转导通路的影响,为黄芩苷应用于类风湿关节炎临床治疗提供实验依据。方法将购买的HFLS-RA细胞进行传代培养,选用4-7代HFLS-RA进行细胞增殖试验(MTT)和药物实验研究。黄芩苷不同浓度组:HFLS-RA无血清的基础培养液中加入不同浓度的黄芩苷(10、20、30μm)及MTX 10μg/ml孵育24小时。对照组:HFLS-RA无血清基础培养液不加任何药物培养24小时。ELISA定量检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β水平,western blot检测滑膜细胞中NF-κB p65、phospho-NF-κB p65(Ser536)和Acetyl-NF-κB p65(Lys310)蛋白表达。结果黄芩苷能明显降低细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β含量,抑制滑膜细胞中NF-κB p65、phospho-NF-κB p65(Ser536)和Acetyl-NF-κB p65(Lys310)蛋白水平表达。结论黄芩苷抑制人成纤维细胞样滑膜细胞(类风湿关节炎)(HFLS-RA)可能是通过抑制炎性细胞因子产生和NF-κB信号转导途径而发挥治疗作用的。

青藤碱对脂多糖诱导的人成纤维滑膜细胞增殖的影响

目的:探讨青藤碱(Sinomenine)对脂多糖诱导的人成纤维样滑膜细胞(Human fibroblast-like synoviocyte,HFLS)增殖的作用及其机制。方法:随机分为空白对照组、脂多糖模型组、青藤碱10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L组。利用脂多糖诱导HFLS的增殖,48 h后加入不同浓度的青藤碱,通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、P53、细胞周期依赖激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白D(CyclinD)的表达,检测核转录因子-κB(NF-κB)、核因子κB受体活化因子(RANK)、核因子κB受体活化因子配体(RANK-L)蛋白表达;ELISA法检测白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白介素1β(IL-1β)的含量。结果:MTT结果显示与空白对照组比较,模型组细胞增殖明显;与模型组比较,不同浓度的青藤碱均能抑制脂多糖诱导HFLS增殖,结果呈浓度依赖性;流式结果表明青藤碱可促进HFLS的凋亡;Western Blot结果提示与模型组相比,青藤碱组Bax、P53的蛋白表达明显升高,Cyclin D、CDK4、NF-κB、RANK、RANK-L蛋白的表达显著降低。结论:青藤碱可以通过抑制RANK及NF-κB的活化减轻脂多糖诱导的HFLS细胞的炎症反应,促进HFLS凋亡,抑制其增殖。

丹皮酚对IL-1β诱导HFLS-RA的保护作用及相关机制研究

目的探讨丹皮酚对白细胞介素(IL)-1β诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)的保护作用及机制。方法将HFLS-RA细胞分为空白对照组,10μg/L IL-1β组及0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚组,采用MTT法检测细胞增殖情况;酶联免疫吸附测定试验(ELISA)法检测HFLS-RA中肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6水平。采用免疫荧光法观察空白对照组、10μg/L IL-1β组及10μmol/L丹皮酚组HFLS-RA中核因子(NF)-κB p65细胞核移位情况;Western blot法检测空白对照组,10μg/L IL-1β组,0.1、1、10μmol/L丹皮酚组及阴性对照组(仅10μmol/L丹皮酚处理)的基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3和Toll样受体-4(TLR4)蛋白表达。将24只雄性DBA/1小鼠随机均分为对照组、CIA组和治疗组,对小鼠进行四肢累计评分,HE染色观察关节组织病理学变化,ELISA法检测滑膜组织中TNF-α、IL-1β水平。结果丹皮酚对IL-1β诱导HFLS-RA细胞增殖无明显抑制作用。与空白对照组相比,10μg/L IL-1β组TNF-α、IL-6、NF-κB p65核移位、MMP-1、MMP-3和TLR4蛋白表达水平均升高,而经丹皮酚干预后可逆转这些改变(P<0.05)。与CIA组相比,治疗组小鼠四肢累计评分明显下降(P<0.05);HE染色结果示丹皮酚治疗48 d时踝关节病理变化有所改善,其中炎性细胞明显下降,软骨破坏减轻。治疗组小鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β水平低于CIA组。结论丹皮酚具有减轻IL-1β诱导HFLS-RA炎性因子表达和缓解CIA小鼠关节炎症状的作用,其机制可能与抑制TLR-4-NF-κB p65通路,减轻炎症反应有关。

龙胆苦苷对类风湿性关节炎的保护作用及其机制

目的通过体内外实验研究龙胆苦苷(Gent)对类风湿性关节炎(RA)的保护作用及机制。方法SD大鼠右后足足趾皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL造模。14 d后,将大鼠分为正常组、佐剂性关节炎(AIA)组、地塞米松(Dex)0.1 mg·kg^-1组、Gent 100和200 mg·kg^-1组并按上述剂量灌胃给药14 d。记录大鼠原发与继发侧足趾容积,Wood法评估关节炎指数,计算胸腺和脾脏指数,HE染色观察大鼠踝关节组织病理学,Western印迹法检测滑膜组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达。滑膜切除术取得RA患者滑膜组织,胶原酶消化法提取原代成纤维样滑膜细胞(FLS),MTT法检测药物细胞毒性,EDU及划痕法分别检测Gent及Dex对TNF-α(10μg·L-1)诱导的细胞异常增殖及迁移的调控作用,免疫荧光法检测NF-κB P65的核转位。结果Gent 200 mg·kg^-1及Dex能显著降低AIA大鼠原发与继发侧足趾肿胀(P<0.05,P<0.01)和大鼠关节炎指数评分(P<0.05)。HE染色显示,Gent及Dex能显著减轻AIA大鼠踝关节滑膜增生,炎细胞浸润,血管翳生成,以及软骨和骨的侵蚀破坏。与AIA组比较,Dex组大鼠胸腺、脾脏严重萎缩(P<0.05,P<0.01),Gent 200 mg·kg^-1对胸腺指数有抑制作用(P<0.05)。Western印迹法结果显示,Gent能抑制AIA大鼠滑膜组织IκB的降解及p-IκB,p-P65的表达(P<0.01)。RA-FLS经TNF-α刺激后,细胞异常增殖及迁移,加入Gent(25,50和100μmol·L^-1)和Dex(100 nmol·L^-1)预保护后,Gent 50和100μmol·L^-1及Dex组细胞增殖及迁移显著降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,Gent 50和100μmol·L^-1及Dex组能显著抑制NF-κB P65的核转位(P<0.05,P<0.01)。结论Gent对RA具有保护作用,其保护作用可能与抑制NF-κB信号通路有关。