三七皂苷R1对紫外线照射人成纤维细胞急性光损伤的保护作用

研究了三七皂苷R1对长波紫外线(UVA)照射人成纤维细胞(human fibroblast,HFB)所导致的急性光损伤的保护作用。采用噻唑蓝(MTT)细胞活性法检测样品在HFB上的最大安全给药剂量,通过将HFB分为UVA组、UVA+三七皂苷R1组(50、100、200μg/mL)和空白组(不予UVA照射),开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR操作,评价HFB细胞外基质(ECM)合成相关基因CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅦ、Elastin和ECM降解相关基因基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达水平。结果表明,5 J/cm2的UVA照射可显著抑制CollagenⅠ、CollagenⅢ和Elastin基因的表达,并显著提升MMP-3的表达水平。而50μg/mL三七皂苷R1可在5 J/cm2的UVA刺激条件下,显著提升CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅦ和Elastin的表达水平,从而抑制因UVA照射导致的HFB急性光损伤。

莫匹罗星软膏和重组人成纤维细胞生长因子治疗大面积烧伤残余创面的疗效研究

目的 探讨应用莫匹罗星软膏和重组人成纤维细胞生长因子 (rh -bFGF)治疗大面积深度烧伤残余肉芽创面的疗效。方法 对 36例大面积烧伤患者残余创面分两组进行自身对照 :治疗组 (36例 )用莫匹罗星软膏和重组人成纤维细胞生长因子治疗 ,对照组 (32例 )用聚维酮碘软膏治疗 ,比较两组残余创面细菌清除率和创面愈合情况。结果 金黄色葡萄球菌 (包括MRSA)和表皮葡萄球菌 (包括MRSE)为残余肉芽创面感染的主要细菌 ;治疗组细菌清除率为 86 0 % ,对照组为 37 1% ,两组间差别有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;治疗组创面平均愈合时间为 (15 7± 3 8)d,对照组为 (2 3 9± 7 4 )d,二者间差别有显著性意义 (P <0 0 1)。结论 应用莫匹罗星软膏和rh -bFGF治疗大面积深度烧伤残余肉芽创面 ,能有效地清除残余创面感染的主要细菌 (金黄色葡萄球菌和MRSA) ,加快创面愈合。

普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维细胞抗衰老作用机制研究

本文通过比较普洱茶提取物、普洱茶多糖、葡萄籽提取物、绿茶提取物、绿茶多酚及维生素C6种天然抗氧化物对体外培养人衰老成纤维细胞（HDF）的作用机制,研究普洱茶等天然抗氧化物对抗复制性衰老的作用功效.试验建立了HDF衰老细胞模型,用含低质量浓度（3.125,6.250 μg/mL）,中质量浓度（12.500,25.000 μg/mL）和高质量浓度（50.000,100.000 μg/mL）的6种组分的培养基培养1～7d,采用MTT法及荧光定量PCR比较细胞的增殖能力、相对存活率以及细胞SOD1,SOD2,CAT,GPx及线粒体D310和D-loop基因的表达量.结果显示：低质量浓度组的6种天然抗氧化物和中、高质量浓度组的普洱茶多糖和维生素C能显著提高衰老HDF细胞的增殖能力（P＜0.05）;绿茶多酚和绿茶提取物可提高衰老HDF细胞SOD1,SOD2,D310和D-loop基因的表达量;普洱茶多糖可显著提高SOD1,GPx和D-loop基因的表达量;维生素C能显著提高SOD1和GPx基因的表达量.可见,6种天然组分均有延缓HDF细胞复制性衰老的功效,且不同天然抗氧化组分之间对细胞的抗衰老功效具有不同的细胞、分子作用机制.

人成纤维细胞生长因子-21分泌型表达及鉴定

利用基因工程手段,将人成纤维细胞生长因子-21(hFGF21)与分泌信号肽相融合,构建得到能够分泌表达FGF21蛋白的表达载体。将该表达载体导入到Rosetta(blue)宿主细胞中,在分泌信号肽的引导下,在细胞周质中表达。经IPTG诱导表达可获得分子量为21 kD的蛋白,Western-Blotting证明该蛋白为FGF21蛋白。经SDS-PAGE证明获得了可溶性的FGF21蛋白。该方法简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF21)成为可能。

H_2O_2诱发人成纤维细胞衰老样变化的基因表达谱

以 5 0 μmol/LH2 O2 作用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞 4次 ,使之出现不可逆的衰老表型 .提取年轻细胞及H2 O2 处理早老细胞的mRNA ,以荧光物Cy3标记年轻细胞cDNA ,Cy5标记H2 O2 处理的细胞cDNA ,并与点有 40 96条人类基因的芯片杂交 ,利用计算机数据处理判断基因是否存在表达差异 .结果显示 :有 12 3种基因的表达变化较显著 ,这些基因参与细胞周期进程、细胞代谢及蛋白质修饰、细胞外基质及细胞骨架蛋白的形成和调节、炎症反应、调节受体酪氨酸蛋白激酶和G蛋白耦联受体信号转导 .

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。

检测人成纤维细胞增殖的XTT比色法

利用 3种不同来源的成纤维细胞 (大鼠肾上皮细胞 ,人胎肺成纤维细胞 ,人成纤维细胞 )的活细胞线粒体脱氢酶在电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯 (phenazinemethosulfate,PMS)的协同作用下 ,还原四氮唑复合物 (XTT)形成可溶性的棕黄色甲簪 (formazan)产物 ,测定细胞甲簪的生成量来反映细胞的生长与活性状态 ,并与传统的四甲基偶氮唑盐 (MTT)方法作比较 .结果表明 ,XTT方法直接测定水溶性的甲簪产物 ,敏感度高于MTT法 ,具有操作简单、快速、灵敏度高、结果准确的优点 ,为成纤维细胞的研究建立了新的检测方法 .

人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定

目的对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定,探讨一种高效的分离及纯化方法,为细胞移植提供种子细胞。方法使用酶消化法原代提取人成纤维细胞,快速贴壁法纯化细胞,对细胞进行形态学观察、HE染色,免疫细胞化学鉴定细胞标志物Vimentin。结果利用倒置显微镜及HE染色,可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞,当细胞汇流时,呈鱼群样或漩涡状排列,且细胞在15代内形态保持不变。结论成功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法,为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。

电离辐射影响人成纤维细胞基因表达谱的数据挖掘

目的从基因表达谱水平探讨2株人成纤维细胞和低剂量电离辐射3个时间点的可能交互效应,掘其差异表达基因。方法应用GeneSifter在线软件和Panther生物学信息数据库,对下载于NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库的12个样品GSM(数据包含2株成纤维细胞和每株细胞3个辐照时间点),运用混合设计二因子的Two-Way ANOVA方法进行数据挖掘,并对差异表达基因进行聚类、主成分分析、模式分类、功能归类分析,最后用GenCLiP软件进行文献挖掘。结果获得41条交互效应的差异表达基因,主成分分析示每株细胞24h时间点的特征向量明显远离其他向量,差异基因表达可分为3种模式。基因功能归类分析提示,多个生物通路如有丝分裂、细胞周期、细胞结构、细胞凋亡等被显著激活,其中参与有丝分裂和细胞周期的差异表达基因由细胞骨架基因、微管运动基因、蛋白激酶基因等构成,细胞凋亡等效应获得文献支持。结论2株人成纤维细胞和低剂量电离辐射3个时间点有交互效应,存在基因差异表达,这些基因有可能成为鉴定成纤维细胞和辐照时间交互效应的生物标记。

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞(hESC)生长的支持作用,建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层,以血清替代品取代动物血清,支持人胚胎干细胞生长,观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖,并保持87%左右未分化表型:碱性磷酸酶(AKP)染色强阳性,阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3),肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)表达强阳性,可见转录因子OCT-4 mRNA表达。核型正常,体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖,可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。

甲壳胺及N—乙酰葡糖胺抑制人成纤维细胞增殖的研究

本文报道了甲壳胺及N—乙酰葡糖胺对体外培养的人成纤细胞的抑制作用以及甲壳胺在动物体内的生物降解。研究结果表明,N—乙酰葡糖胺和甲壳胺的抑制作用分别为ID_(50)=16.35mg/L,和ID_(50)=69.59mg/L;经过25d和18d兔体内埋植观察,甲壳胺分子量下降分别约为17％和6％。这一现象提示,甲壳胺在长效抑制人纤维增殖方面有潜在的应用价值。

金纳米花粒子对体外人成纤维细胞的毒性作用

目的:探讨具有近红外吸收功能的金纳米花粒子对人成纤维细胞的体外细胞毒性作用,为其在生物医学领域的应用提供依据。方法:分离培养人成纤维细胞,采用含不同浓度金纳米花粒子(1.875、3.750、7.500、15.000、30.000mg.L-1)的含金培养液进行培养,以不加金纳米粒子组为空白对照组,应用MTT比色法检测其细胞毒效应,倒置显微镜观察细胞形态。结果:培养液中加入不同浓度金纳米花粒子后,各组细胞相对增殖率(RGR)分别为92.245%、88.980%、86.939%、75.782%和71.756%,加入30.000mg.L-1金纳米花组,其RGR与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),各组毒性评级均为一级。倒置显微镜下可见加入低浓度金纳米花粒子的人成纤维细胞形态正常,生长良好。结论:此种具有近红外吸收功能的金纳米花粒子体外细胞毒性具有剂量依赖性,低浓度金纳米花粒子具有良好的生物相容性。

体外培养不同代次人成纤维细胞的衰老程度

目的:探讨体外培养不同代次人成纤维细胞的衰老程度,为组织工程化皮肤提供合适的种子细胞。方法:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成。取6～8岁正常男性儿童20例包皮环切术切除的健康包皮组织,将包皮二倍体成纤维细胞进行传代培养,以不同代次(P0,P5,P10,…,P65)的细胞为实验对象,通过倒置相差显微镜、透射电镜、衰老相关β-半乳糖苷酶染色一系列检测方法,对不同代次成纤维细胞的衰老程度进行观察。结果:①成纤维细胞的形态学:P45以内成纤维细胞生长迅速,两三天即呈汇合状态,细胞排列紧密,多呈放射状、编织状或漩涡状走行,有的交叉重叠生长。P46以后细胞排列不规则,体积较大,形状扁平,胞浆区域增大,胞质突起多而大,胞内出现颗粒和空泡,边界不清,形态不规则;成批的细胞出现固缩、脱落,有离壁漂起的现象。②透射电镜结果:P0～P40:成纤维细胞胞质内有丰富的粗面内质网;细胞核大,核仁明显;细胞表面有许多短小突起,可见微绒毛和胞浆皱褶。P41～P65:细胞核/浆比例减小,细胞表面突起和微绒毛减少;核膜内折,有凋亡现象。③细胞生物学行为的改变:P60增殖速度较P10明显减慢。P10最大增殖数为47.3×105,对数生长期在3～6d,细胞倍增时间为2.18d;P60最大增殖数为8.5×104,对数生长期在4.0～7.5d,群体倍增时间为3.86d。④衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果:与P10相比,P60中阳性细胞率大为增强(阳性细胞率为4%和60%);直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:各代成纤维细胞老化程度不同,46代后的细胞老化明显,不适合作为组织工程化皮肤的种子细胞。

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。方法:将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2cNDA和人成纤维细胞生长因子2cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Westerblot方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果与结论:转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。

几种生物材料种植人成纤维细胞的比较

目的 通过人成纤维细胞种植 ,比较几种形式的聚酯材料 ,以及脱细胞生物组织基质的细胞亲和性 ,为组织工程血管及瓣膜研究选择支架材料。方法 ①聚氨酯 (PU)、第 3代聚烷酸酯 [PHAs ,分子表达式为p( 3HB -co -3HH) ]、PHAs/PU共混物分别涂在载波片上制成薄膜 ,将人成纤维细胞种植其上 ,培养 3天。HE染色后于显微镜下每片取相同 4点计数 ,得出平均值。②分别在PHAs/PU片、脱细胞牛心包片、脱细胞猪肺动脉瓣 (简称猪瓣 )种植人成纤维细胞 ,PHAs/PU片培养 7天 ,后两者培养 3天。用HE染色、扫描电镜分别观察细胞生长情况。结果 ① 3组薄膜片上细胞平均数分别为 (PU) 196、(PHAs) 12 4、(PHAs/PU) 160。②扫描电镜显示PHAs/PU片表面约 5 0 %有细胞覆盖 ,细胞聚合成粗大束带状结构 ,牛心包表面紧密覆盖着厚实的鳞甲状细胞结合体 ,猪瓣瓣叶表面覆盖紧密联结的板状细胞结合体。③HE染色显示PHAs/PU片和牛心包片、猪瓣瓣叶单侧有联结较完整的细胞层覆盖 ,局部有 3～ 4层重叠而成 ,牛心包片和猪瓣瓣叶上细胞与基质联结紧密。结论 ①PHAs混入PU后细胞亲和性显著提高 ,适宜作血管及补片支架材料 ;②脱细胞牛心包组织和猪瓣细胞亲和性明显好于合成材料 ,适合作血管。

槲皮素对人成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的探讨槲皮素对人成纤维细胞(HSF)生长及胶原分泌能力的影响。方法原代培养HSF,并以不同浓度的槲皮素干预24 h,以MTT法检测细胞增殖能力,以流式细胞术测定其细胞周期,对培养上清用碱水解法测定其中羟脯氨酸(Hyp)含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定Ⅰ型胶原(ColⅠ)及透明质酸(HA)含量。结果槲皮素作用HSF 24 h后,与对照组比较,槲皮素各剂量组细胞处于增殖期的细胞数目、增殖能力逐渐增加(P<0.05),并呈现一定的剂量效应关系;不同浓度槲皮素作用于HSF 24 h后,培养上清中Hyp、ColⅠ及HA含量均明显高于对照组(P<0.05),并具有剂量-效应关系。结论槲皮素可促进HSF增殖、刺激其分泌胶原及HA,对维持皮肤弹性、减少皮肤皱纹形成、延缓衰老有重要意义。

人成纤维细胞株辐射诱导凋亡与辐射敏感性相关性研究

为探讨不同放射敏感性人成纤维细胞株经辐射诱导后的凋亡情况，应用Ｔｕｎｅｌ法及流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞凋亡，以６０Ｃｏγ射线处理细胞。结果表明（１）６０Ｃｏγ射线照射后，集落形成实验表明，６号细胞株辐射敏感性高于８号细胞株。（２）Ｔｕｎｅｌ法和流式细胞术检测结果表明，凋亡率与辐射敏感性成正比，同样反映出６号细胞株辐射敏感性高于８号细胞株。（３）检测还发现，凋亡率与辐射剂量和辐射后时间成正比。说明凋亡率的变化能够反映细胞株的辐射敏感性水平；凋亡率与辐射剂量和时间呈依赖关系，有可能成为推断辐射敏感性的重要指标之一。

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .

表皮生长因子诱导人成纤维细胞基因表达谱的变化

深入研究EGF对靶细胞的作用有助于揭示细胞增殖、转化、凋亡以及胚胎发育的分子机理。本文采用cDNA微阵列技术,检测EGF持续作用48小时后人胚肺二倍体成纤维细胞基因表达谱的变化。结果显示:EGF长期作用诱导广泛的基因表达变化,在所检测的4096种人类基因中,有855种发生了变化,这些表达变化的基因参与细胞的能量代谢、生物合成、细胞周期调控及受体酪氨酸激酶和G蛋白耦连受体信号转导等细胞反应,其中最显著的变化趋势是GPCR及其相关蛋白基因表达的下调。

体外培养人成纤维细胞转化生长因子-β_1自分泌规律的研究

目的 探讨体外培养人成纤维细胞转化生长因子 -β1 (TGF-β1 )的自分泌规律。方法 应用健康人包皮环切术所得包皮 ,通过体外成纤维细胞传代培养共 12代 ,运用 EL ISA法 ,分别检测不同代次成纤维细胞 TGF-β1 浓度 ,并测定第 6代成纤维细胞在不同时间培养上清液中 TGF-β1 的浓度。结果 自第 3代开始 ,成纤维细胞培养上清液可检测到 TGF-β1 ,并逐渐升高 ,至第 6代达分泌高峰 (45 0 ng/ L ) ,第 11、12代不能测到 ;而第 6代成纤维细胞 ,培养上清液中 TGF-β1 含量以第 5天的检测值最高 (6 80 ng/ L ) ,是第 1天检测值 (2 80 ng/ L )的 2 .5倍。结论 成纤维细胞 TGF-β1 自分泌能力 ,是由弱到强再逐渐减弱的过程 。