人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白-1(OP-1)成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5K为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。

人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.

贻贝启发接枝骨形态发生蛋白2成骨活性肽的介孔生物玻璃修复股骨髁缺损

背景:骨形态发生蛋白2在胚胎发育、骨骼形成和再生修复中具有重要作用,但高剂量应用与癌症发病密切相关。骨形态发生蛋白2成骨活性段L20能够有效减少癌症等不良反应,并可显著促进骨组织再生。目的:将骨形态发生蛋白2活性肽段以贻贝衍生肽模拟策略接枝在介孔生物玻璃表面,探究其对组织工程成骨性能的影响。方法:(1)采用模板法合成介孔生物玻璃纳米颗粒,采用一步法合成负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20的介孔生物玻璃纳米颗粒,表征负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔活性玻璃纳米颗粒的形貌与体外缓释性能。(2)分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,传2代后分别与PBS(空白组)、介孔生物玻璃纳米颗粒(对照组)、负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒(实验组)共培养,采用细胞活死荧光染色和CCK-8法检测细胞毒性和细胞增殖,扫描电镜观察细胞黏附;成骨诱导分化后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红S染色与成骨相关基因表达检测。(3)取15只SD大鼠,建立双侧股骨髁缺损模型,采用随机数字表法分为3组:空白组(n=5)不植入任何材料,对照组(n=5)植入介孔生物玻璃纳米颗粒,实验组(n=5)植入负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒。术后8周,进行股骨Micro-CT扫描与组织形态观察。结果与结论:(1)扫描电镜下可见负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒为球形、单分散颗粒,透射电镜下可见其具有多孔结构,平均粒径为(268.10±0.58) nm,体外可缓释L20。(2)负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒无细胞毒性,并且可促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附;与空白组、对照组相比,实验组碱性磷酸酶活性与细胞外基质矿化能力均升高(P <0.05),碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA表达升高(P <0.05)。(3)股骨Micro-CT扫描结果显示,与空白组、对照组相比,实验组新生骨量与骨密度均升高(P <0.05);苏木精-伊红与Masson染色结果显示,与空白组、对照组相比,实验组新骨生成与胶原纤维均增加。(4)结果表明,负载骨形态发生蛋白2活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒具有良好的生物相容性及体内外促成骨性能,可促进SD大鼠股骨髁缺损的再生修复。

先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白-5成熟肽基因突变研究

目的:探讨骨形态发生蛋白-5(BMP5)成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。方法:收集临床确诊的散发先天性小耳畸形患者35例,用Trizol提取外周血白细胞总RNA,利用反转录-聚合酶链反应-单链构象多态性分析(RT-PCR-SSCP)技术进行BMP5成熟肽基因的突变分析,对异常电泳条带的RT-PCR产物进行核苷酸序列测定,明确突变位点和方式。结果:从35例先天性小耳畸形患者中检测到1种错义突变:第213位点发生TTTT→ACAC突变,编码氨基酸改变为苯丙氨酸→组氨酸。结论:检测到的BMP5成熟肽基因突变可能为致病突变,其与先天性小耳畸形发病的关系有待于进一步研究。

人成骨蛋白-1成熟肽基因5’端的修饰及其在大肠杆菌中的表达

目的：对人成骨蛋白－１（ＯＰ－１）成熟肽基因进行修饰、克隆并在大肠杆菌中表达、检测，为ＯＰ－１的进一步纯化、复性、诱骨活性的研究以及未来的临床应用奠定基础。方法：在不改变氨基酸的前提下，用ＰＣＲ的方法对ＯＰ－１的成熟肽Ｎ端序列加以修饰，将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３’端０．４２ｋｂ基因片段克隆于温控型大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０，受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。用鼠抗牛天然ＢＭＰｓ单抗对表达产物进行ＥＬＩＳＡ检测和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ确证。结果：工程菌经４２℃、５ｈ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新的蛋白带，分子量在１．６×１０４ｕ左右，约占菌体总蛋白的１９．８％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后，可获得纯度较高的重组人成骨蛋白－１成熟肽（ｒｈＯＰ－１）。表达产物的ＥＬＩＳＡ检测和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｎｇ确证确均呈阳性反应。结论：表达产物即为目的蛋白，使ｈＯＰ－１成熟肽基因５’端的修饰及其在大肠杆菌中的表达在国内第一次获得成功。

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

家兔关节软骨骨形成蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 证实家兔膝关节软骨中骨形成蛋白-7(BMP-7)的表达,获得BMP-7成熟肽基因。方法 提取家兔膝关节细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增BMP-7成熟肽基因并克隆人T载体,筛选阳性克隆质粒进行核酸序列分析。结果 PCR扩增得到一特异性的约630 bp片段,克隆后筛选出阳性克隆质粒,序列测定结果表明与发表的BMP-7成熟肽基因序列一致。结论 家兔膝关节软骨细胞中有BMP-7成熟肽基因的表达,克隆得到了BMP-7成熟肽基因,为BMP-7在软骨发育中的作用及其功能研究奠定了基础。

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。

骨形态发生蛋白/Wnt信号通路调控成骨:揭示骨骼形成和重塑的分子机制

背景:成骨细胞是负责骨骼形成和重塑的主要细胞类型,其功能的正常发挥受到多种信号通路的精密调控,其中,骨形态发生蛋白和Wnt信号通路在成骨过程中起着关键作用。目的:综述了骨形态发生蛋白/Wnt信号通路在调控成骨细胞功能中的作用,并分析其在不同生理和病理条件下的变化,以期进一步揭示骨骼形成和重塑的分子机制。方法:以中文检索词“BMP信号通路,Wnt信号通路,成骨”及英文检索词“BMP signaling pathway,Wnt signaling pathway,osteogenesis”在中国知网、万方和PubMed数据库中检索研究原著,检索时限为各数据库建库至2023年6月的相关文献,最终筛选61篇文献进行分析总结。采用文献综述的方法,对骨形态发生蛋白/Wnt信号通路调控成骨作用的研究进行梳理和分析。结果与结论:①骨形态发生蛋白和Wnt信号通路在成骨细胞的分化、增殖和成熟过程中发挥重要作用。骨形态发生蛋白信号通路主要通过激活Smad蛋白来调控成骨相关基因的表达,Smad蛋白被激活后进入细胞核,调控与成骨相关的基因表达,与骨形态发生蛋白不同,Wnt信号通路主要依赖于β-catenin的激活来发挥生物学效应。②不同生理和病理状态下,骨形态发生蛋白/Wnt信号通路的调控作用会受到多种因素的影响。生长因子及激素及机械应力等会在一定程度上影响骨形态发生蛋白/Wnt信号通路的活性。③骨形态发生蛋白/Wnt信号通路在调控成骨过程中与其他信号通路相互作用,共同构成复杂的调控网络。④中药和天然化合物可以通过调控信号通路来促进骨骼健康,为中药治疗骨骼疾病提供了新的可能性。⑤未来研究可进一步探讨骨形态发生蛋白/Wnt信号通路与其他信号通路的相互作用以及其在不同生理和病理条件下的变化,解析此复杂网络中的关键节点和调控机制,为骨骼相关疾病的治疗提供更精确的靶点,也为揭示骨骼形成和重塑的分子机制提供新的思路。

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。

降钙素基因相关肽通过抑制Nod样受体蛋白3表达促进小鼠成骨细胞分化的研究

目的研究降钙素基因相关肽(CGRP)作用下相关炎症体和信号因子的表达变化,探讨CGRP对成骨细胞分化的作用机制。方法将不同浓度的CGRP(0、10、30、100 ng·m L-1)加入到成骨细胞中,采用实时聚合酶链反应技术检测细胞内Nod样受体蛋白3(NLRP3)及白细胞介素-1β(IL-1β)m RNA的表达水平,蛋白质印迹法检测NLRP3的蛋白表达,酶联免疫吸附测定检测IL-1β的蛋白表达,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)含量,茜素红染色显示成骨细胞分化情况。结果随着CGRP浓度的增加,NLRP3和IL-1β的蛋白表达及m RNA表达均呈降低趋势(P<0.05),而且细胞内ROS浓度逐渐下降(P<0.05)。100 ng·m L-1CGRP实验组较0 ng·m L-1CGRP对照组显著促进成骨细胞分化。结论 CGRP在一定条件下,可通过抑制细胞内炎症因子的表达促进成骨细胞分化。

猪骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及序列分析

克隆猪骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽基因。通过提取猪肾的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出目的基因,并将其回收后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行阳性克隆的筛选与鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物,显示结果与预期片段大小一致,质粒PCR检测、酶切鉴定证实重组克隆中插入了PCR产物,测序结果揭示BMP-4成熟肽cDNA长为351bp,编码116个氨基酸。序列对比表明,猪与人、小鼠、牛、绵羊BMP-4成熟肽cDNA序列的同源性分别为94.87%、90.60%、94.87%、94.59%,而相应的氨基酸同源性分别为99.12%,99.12%,100%、100%。首次成功地克隆了猪BMP-4成熟肽编码基因,对于进一步研究猪BMP-4全基因结构、功能及其与繁殖性能的关系有重要的意义。

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的 cDNA基因,并在大肠杆菌中表达.方法:从人胎盘组织中提 取总RNA,以其为模板,采用RT PCR方法得到编码hBMP4 的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转 化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达.结果:获得hBMP4mcDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证 实所插入的hBMP4mcDNA序列与设计预期一致;将获得重 组表达质粒pDH2 hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱 导,目的蛋白占细菌总蛋白的41.5%.结论:采用分子克隆的 方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在 大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达.

人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的扩增、克隆人成骨蛋白1(humanosteogenicprotein1,hOP1)成熟肽cDNA基因,并利用大肠杆菌表达hOP1成熟肽。方法PCR扩增hOP1成熟肽cDNA基因,将其克隆入受控于含有PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH,构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达,表达产物纯化和复性后,以小鼠肌袋模型检测诱骨活性。结果扩增得到hOP1成熟肽基因;含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDSPAGE上出现一条新蛋白条带,分子量约为16ku,表达量占菌体总蛋白的21%,以包涵体形式存在,经纯化和复性处理,得到纯度高于85%、具有良好异位诱导成骨活性的hOP1成熟肽。结论成功克隆出hOP1成熟肽基因,并在大肠杆菌中得到高效表达,复性后具有诱骨活性。

降钙素基因相关肽联合重组人骨形态发生蛋白对兔成骨样细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的研究降钙素基因相关肽（CGRP）及重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）在促进兔骨髓来源成骨样细胞增殖和分化方面是否有协同作用。方法取经诱导第三代兔骨髓基质细胞获得的兔成骨样细胞以2×10^6／ml的浓度接种于96孔板，分为6组，用含有不同条件的培养基进行培养。包括①A组：空白对照组，②B组：0．05ng／mlCGRP，③C组：5ng／ml CGRP，④D组：100ng／ml rhBMP-2，⑤E组：5ng/ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2，⑥F组：0．05ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2。用四唑盐比色法（MTT）法测定细胞增殖情况和碱性磷酸酶（ALP）染色法检测其对ALP活性的影响。结果①100ng／ml rhBMP-2组、0．05ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2组、5ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2组细胞增殖OD值比对照组显著增强（P〈0．05），其中0．05ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2组最强（P〈0．01）。②100ng／mlrhBMP-2组、0．05ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2组、5ng／ml CGRP＋100ng／ml rhBMP-2组，3组之间的ALP表达无明显差异（P〉0．05），但3组与对照组相比显著增强（P〈0．05）。结论CGRP和rhBMP-2合用对兔骨髓来源成骨样细胞的增殖有一定的协同作用，但对ALP无协同作用，与单用rhBMP-2的效果相当。

重组人骨形成蛋白成熟肽4对急性放射损伤小鼠造血系统的修复作用

目的探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对^(60)Coγ射线照射引起的小鼠造血系统损伤的修复作用。方法 90只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和rhBMP-4m治疗组,每组30只。模型组和rhBMP-4m治疗组小鼠接受^(60)Coγ射线照射,照射剂量7 Gy,全身照射200 s;正常对照组小鼠不接受照射。模型组小鼠每日腹腔注射生理盐水1.0 mL,rhBMP-4m治疗组小鼠每日腹腔注射rhBMP-4m 0.5 mg,连续治疗6 d。分别于照射后第1、3、5、7、9天检测小鼠外周血白细胞数、骨髓单个核细胞数、骨髓单个核细胞中CD34^+细胞比例;照射后第9天进行脾结节计数,并计算脾脏质量与体质量的比值(脾体比)。结果照射后第1天3组小鼠外周血白细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05);照射后第3、5、7、9天模型组小鼠外周血白细胞计数低于正常对照组(P<0.01);照射后第3、5天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点骨髓单个核细胞计数均低于正常对照组(P<0.01)。照射后第1、3天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点的单个核细胞中CD34^+细胞百分率均低于正常对照组(P<0.01)。rhBMP-4m治疗组小鼠照射后第1、3天单个核细胞中CD34^+细胞百分率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠单个核细胞中CD34^+细胞的百分率高于模型组(P<0.05)。照射后第9天,模型组小鼠脾结节计数高于正常对照组,脾体比低于正常对照组(P<0.05);rhBMP-4m治疗组小鼠脾结节计数和脾体比高于模型组(P<0.01)。结论辐射可引起小鼠骨髓造血系统损伤,rhBMP-4m能够促进骨髓造血系统的重建。