基于Label-free定量蛋白组学揭示肠道病毒A71型感染致人扁桃体上皮细胞蛋白质组的改变

肠道病毒A组71型(Enterovirus-A71,EV-A71)感染引起的手足口病给婴幼儿造成严重的疾病负担,明确EV-A71的致病机制能为有效防控手足口病提供科学依据。为了研究EV-A71感染与人扁桃体上皮细胞的互作,本研究采用Label-free定量蛋白组学技术研究EV-A71感染人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B 6h和12h后蛋白质组的改变情况,并确定EV-A71感染动力学(EV-A71 6h∶12h)过程中蛋白质组的改变情况,并进行差异表达蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs)的蛋白互作网络和基因本体(Gene ontology,GO)分析。EV-A71感染6h时共有27个DEPs(下调12个DEPs,上调15个DEPs)发生显著改变;EV-A71感染12h时共有62个DEPs(下调26个DEPs,上调36个DEPs)发生显著改变;EV-A71感染动力学(EV-A71 6h∶12h)过程中共有40个DEPs(下调21个DEPs,上调19个DEPs)发生显著改变。显著发生改变的COX6C、TIMM10、MAP1LC3B、HIST1H1D、DNAJC8、TMED4和ARPC5等DEPs为各组间重叠蛋白。蛋白互作网络和GO分析结果显示,DEPs主要涉及到线粒体及线粒体膜的通透性调节、细胞囊泡形成、细胞凋亡、线粒体介导的凋亡等生物学过程。因此,EV-A71感染使人扁桃体上皮细胞的蛋白表达谱发生改变。

人鼻病毒1B感染人扁桃体上皮细胞和人肺支气管上皮细胞的比较代谢组学研究

人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)是呼吸道感染的主要病原体之一,明确HRV的致病机制能为有效防控该病毒感染提供科学依据。为确定1B型HRV(human rhinovirus type 1B,HRV1B)感染致宿主细胞的代谢组改变及差异性,本文采用非靶向代谢组学技术研究HRV1B感染人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B和人肺支气管上皮细胞BEAS-2B后代谢组的改变情况。HRV1B感染UT-SCC-60B细胞6h和12h分别有21个差异显著代谢产物(differentially significant metabolites,DSMs)(上调13个、下调8个)和51个DSMs(上调42个、下调9个),HRV1B感染UT-SCC-60B和BEAS-2B细胞6h和12h后,比较分析发现分别有303个DSMs(上调69个,下调234个)和324个DSMs(上调88个,下调236个),未知DSMs占据比例较大。脂肪酸、脂质、氨基酸、核苷酸和糖类的比例随着感染时间的延长而增加,7-酮基脱氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱、垂盆草甙、组氨酸-甘氨酸、腺苷酸等涉及到胆汁酸代谢、脂肪酸和脂质代谢、糖代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢。因此,细胞水平表明HRV1B感染改变了人上皮细胞的脂肪酸、脂质、氨基酸、核苷酸和糖类的代谢水平。

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的:建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法:收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶-EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果:Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法(P<0.05),细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论:应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶-EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。

高通量测序确定肠道病毒A71型感染致宿主细胞miRNA表达谱的改变

目的确定肠道病毒A71型(Enterovirus-A71,EV-A71)感染人扁桃体上皮细胞后miRNA表达谱的改变。方法EV-A71以感染复数为1感染人扁桃体上皮细胞6 h后,采用Trizol提取总RNA,构建小RNA文库,在Illumina NextSeq 500平台进行高通量测序,处理数据后确定差异表达的已知和新型miRNA种类及其靶基因,进行基因本体和信号途径分析;使用psRNATarget预测具有潜在结合EV-A71基因组的差异表达的miRNA种类。实时定量RT-PCR检测差异表达miRNA的变化倍数。结果通过高通量测序共鉴定61个已知差异表达的miRNA(下调21个、上调40个)和559个新型miRNA,新型miRNA具有典型的前miRNA的二级发卡结构。实时定量RT-PCR确定hsa-miR-517b-3p和hsa-miR-199a-5p的变化倍数与高通量测序结果基本一致。差异表达miRNA靶基因涉及到不同的生物学过程和信号途径。共鉴定出24个差异表达的miRNA(5个已知miRNA,19个新型miRNA)具有与EV-A71结合的潜在"种子序列"。结论EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后引起miRNA表达谱的显著改变,且差异表达的miRNA可能靶向结合EV-A71基因组进而调控EV-A71复制。