人抗凝血酶Ⅲ纳米膜过滤工艺优化

目的考察Asahi Kasei（旭化成）公司纳米膜过滤人抗凝血酶Ⅲ（Human AntithrombinⅢ,ATⅢ）的回收率,优化纳米膜过滤工艺。方法选取旭化成公司3种不同规格型号的纳米膜Planova~15N,Planova~20N和Planova~Bio EX进行ATⅢ过滤回收率考察,通过留取生产工艺中不同阶段不同蛋白浓度的制品,优化过滤蛋白总量,确定纳滤米过滤工艺位置。结果蛋白浓度16 mg/m L的ATⅢ通过Planova~20N过滤获得蛋白总量最高,ATⅢ蛋白及效价回收率也较高,为最佳纳滤蛋白浓度。结论通过本研究筛选出Planova~20N,最佳纳滤蛋白浓度为16 mg/m L,经去除病毒验证其对细小病毒的去除率LRV〉4.0,最终确定纳滤工艺在人抗凝血酶Ⅲ工艺中超滤浓缩后,既符合生产工艺要求并可获得高回收率。

人抗凝血酶Ⅲ研究进展

人抗凝血酶Ⅲ(Human Antithrombin,hATⅢ)是机体抗凝系统发挥其生理功能的主要因子,对血液循环、血浆渗透压平衡、止血抗凝、抗炎等机制均具有重要作用,与各种疾病的表征高度相关。该文综述了hATⅢ的基因结构、蛋白结构、生物功能以及其重组表达等方面的研究进展,对hATⅢ的研究进行了展望,旨在为hATⅢ研究工作者提供参考。

人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法验证及应用

本文参照药品质量标准分析方法验证指导原则,在验证中对专属性、线性、准确度、中间精密度、重复性和范围6个参数进行确认,以考察成都蓉生药业有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin III,ATIII)效价检测方法是否符合要求。通过验证,人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法在专属性、线性、准确度、中间精密度、重复性和范围6个方面均符合要求,因此此方法可用于成都蓉生药业有限公司人抗凝血酶Ⅲ效价检测。通过验证确认人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法的检测范围是0.0057-0.0130IU/ml。

人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)在毕赤酵母中可溶性表达

目的 研究重组AT Ⅲ基因在巴斯德毕赤酵母菌中进行表达。方法 将携带AT Ⅲ基因的表达载体电转染GS115细胞 ,用G4 18筛选抗性克隆 ,用SDS PAGE及WesternBlot检测表达产物的纯度及特异性 ;用生化法检测AT Ⅲ的表达量 ;用凝血酶空斑法检测表达产物活性。结果 表达产物能与抗AT Ⅲ单克隆抗体结合 ,并具有天然AT Ⅲ的生物活性。结论 已在毕赤酵母菌中成功地表达了AT Ⅲ。

人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中的病毒灭活/去除效果的研究

目的:对人抗凝血酶Ⅲ(Human AntithrombinⅢ,ATⅢ)生产工艺的病毒灭活/去除效果进行研究。方法:选取PRV、SV、EMCV和MVM作为指示病毒,考察了S/D处理法、冻干干热法和纳米膜过滤工艺的病毒灭活/去除能力。结果 S/D处理法灭活PRV达到5.250 Lg TCID50/ml,灭活SV达到5.544 Lg PFU/ml;冻干干热法灭活PRV达到4.750 Lg TCID50/ml,灭活EMCV达到6.000 Lg TCID50/ml,灭活SV达到7.760 Lg PFU/ml;纳米膜过滤法去除MVM达到5.375 Lg TCID50/ml。所有的指示病毒均能被有效地灭活/去除。结论:上述方法均能安全有效地灭活/去除人抗凝血酶Ⅲ中的病毒。

气相色谱内标法测定人抗凝血酶Ⅲ磷酸三丁酯残留量

人抗凝血酶Ⅲ（antithrombinm，AT-Ⅲ）是血液中重要的抗凝血因子，可抑制血液中75％的凝血酶活力，使激活的FIX、FX、FXI和FXD失去活性。AT-Ⅲ水平降低时，血浆抗凝血活性降低，易形成血栓。自1974年AT-Ⅲ试用于临床以来．其疗效及适应证也13益增多。

乳腺生物反应器表达的重组人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质,利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ(rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注,如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和层析的纯化工艺,实现了rhAT Ⅲ的高效、快速纯化。先用等电点沉淀法,快速去除了占总蛋白50%左右的酪蛋白;然后用肝素亲和层析纯化rhAT Ⅲ,并系统考察了pH值和温度对rhAT Ⅲ稳定性的影响,以及pH值和操作条件(洗脱梯度、流速和上样量)对rhAT Ⅲ分离效果的影响。在优化的条件下,rhAT Ⅲ纯度达到99%以上,蛋白收率达到90%,活性收率约为50%。所建立的纯化工艺简单、快速,rhAT Ⅲ收率高,为今后工艺放大提供了重要的依据和参考。

交叉免疫电泳法对人抗凝血酶-Ⅲ肝素结合组分的检测

目的建立检测人抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)中肝素结合组分的方法。方法利用火箭电泳法确定AT-Ⅲ抗原抗体比例,以交叉免疫电泳法检测AT-Ⅲ中的肝素结合组分,加热处理方法制备无肝素结合力的AT-Ⅲ样品。结果免疫电泳检测显示沉淀峰清晰,明确分辨出AT-Ⅲ样品中肝素结合组分及非结合组分并计算比例:混合血浆中结合肝素的AT-Ⅲ组分比例约为85.8%,AT-Ⅲ标准品、商业化制品及本实验室自制样品中结合肝素的AT-Ⅲ组分比例均接近100%。AT-Ⅲ样品经热处理(60℃,10h)后,不含枸橼酸钠的样品全部失去肝素结合力,在枸橼酸钠作保护剂的样品中,肝素结合组分占68.5%。结论建立的交叉免疫电泳法能够有效用于人AT-Ⅲ研发、生产时样品中肝素结合组分的检测。

人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险分析

目的:研究转基因羊发生基因漂移的可能性。方法:利用实时荧光定量PCR技术检测人抗凝血酶Ⅲ转基因羊及与其密切接触的野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转β-干扰素转基因羊、狗、鸡和鹅的血样中人抗凝血酶Ⅲ基因的含量。结果:人抗凝血酶Ⅲ转基因只在人抗凝血酶Ⅲ转基因羊血液中检测呈阳性。结论:人抗凝血酶Ⅲ基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移,提示转基因羊对于环境是安全的。

人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中活性检测方法的建立及初步应用

目的建立和验证全自动凝血分析仪检测人抗凝血酶Ⅲ(human antithrombinⅢ,AT-Ⅲ)活性的方法。方法参照全自动凝血分析仪操作说明书进行AT-Ⅲ活性的检测,并对方法的线性、检测范围、精密度和准确度进行方法学验证。结果全自动凝血分析仪检测AT-Ⅲ活性的方法稳定,仪器自动运行标准曲线的决定系数均>0.980,定标血浆标准曲线线性范围为0.12~1.23 IU/ml,定标血浆高、中、低值和定量下限稀释样品的效价回收率均在80%~120%范围内,且高、中、低值效价回收率的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<15%,定量下限稀释样品的效价回收率的RSD<20%,供试品的批内精密度RSD均<5%,批间精密度RSD均<10%,对3批AT-Ⅲ制品及其中间品进行活性检测,每批样品分别测定3次的平均RSD均<5%。结论全自动凝血分析仪检测AT-Ⅲ活性的方法具有较好的线性、检测范围、准确度和精密度,可用于AT-Ⅲ生产工艺中活性的检测。

从1升山羊乳成功地分泌7克AT-Ⅲ

美国Genzyme Trangenies公司从1升重组山羊乳汁中以工业水平生产7克人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。该公司决定作为以动物工厂生产的第一种医药品开发AT-Ⅲ,并着手工业化。去年11月已向美国食品与药物管理局(FDA)申报。为进入临床试验与FDA商谈重组AT-Ⅲ的安全性评价法和GMP标准(优良制造规范)等。

抗人ATⅢ单克隆抗体的研制

目的：建立人抗凝血酶Ⅲ（ Ａ Ｔ Ⅲ）的 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测试剂盒及 Ａ ＴⅢ的纯化提供试剂准备。方法：用 Ａ ＴⅢ进行 ２ 次基础免疫、２ 次加强免疫的方法免疫 Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠，经间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 的方法筛选杂交瘤细胞株，通过吸收试验、免疫印迹试验等进行特异性分析。结果：筛选出１５ 株分泌抗人 Ａ ＴⅢ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对其中３ 株（ Ｂ４、 Ｂ５、 Ｂ７）作进一步研究，３ 株杂交瘤细胞分泌抗体亚型均为 Ｉｇ Ｇ１ 型，３ 株细胞培养上清滴度平均达到４×１０３，小鼠腹水滴度平均达到 ４×１０６，３ 株抗体均具抗人 Ａ ＴⅢ的特异性。结论：所筛选的单抗为 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测试剂盒的制备及 Ａ ＴⅢ的纯化提供了试剂准备。

两种方法检测人抗凝血酶-Ⅲ活性的对比分析

目的对比分析两种检测人抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ）活性的方法。方法分别用手工法和仪器法检测AT-Ⅲ活性,手工法根据《欧洲药典》8.0中AT-Ⅲ含量检测2.7.17项的要求进行检测,仪器法是利用法国STAGO全自动血凝仪及其配套试剂进行检测。同时对两种方法检测结果的直线回归相关系数、重复性、准确性进行验证。结果两种方法的直线回归相关系数均〉0.99,RSD均〈10%,回收率均在80%~120%之间。结论两种方法的一致性良好,且仪器法更省时省力,效率更高。

口腔扁平苔藓患者血清差异蛋白表达检测及意义

目的探讨口腔扁平苔藓(OLP)患者血清差异蛋白表达及意义。方法选择6例OLP患者(观察组)和6例健康志愿者(对照组),抽取空腹静脉血后采用苯酚抽提法提取血清蛋白,Bradford法测定蛋白含量,双向荧光差异凝胶电泳法分离检测差异蛋白点,液相色谱-质谱联用技术鉴定差异蛋白。选择其中研究较少的蛋白,采用Western blotting法检测两组蛋白相对表达量。结果两组血清差异蛋白点(583±183)个,其中重复性好的蛋白差异点20个,质谱分析蛋白序列鉴定出12种蛋白质。12种蛋白质中,7种(补体C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型Ig A、补体C9、β-1-金属结合球蛋白)在观察组血清中表达降低,5种(结合珠蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白AⅠ、维生素D、人类因子B)表达升高。观察组血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相对表达量均低于对照组,载脂蛋白AⅠ高于对照组(P均<0.01)。结论 OLP患者血清中存在12种差异蛋白质,血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白表达均降低,载脂蛋白AⅠ表达升高,其发病可能与免疫功能降低及感染有关。

天津市2000年医药卫生科研进展

一、中国医学 人参皂甙是人参的重要有效成分,对血液系统的作用,除能改善血液的流变性、降血脂、抗动脉粥样硬化外,还可促进骨髓DNA、RNA、蛋白质及脂质的合成.脐血富含造血干/祖细胞,是髓外造血细胞的主要来源,在治疗血液病、难治性贫血、重症免疫缺陷病和实体瘤方面均显示了广阔的前景,天津市血液中心采用体外半固体培养法和流式细胞技术,观察了人参皂甙对脐血细胞造血功能的影响.结果显示,人参皂甙可以刺激脐血造血干/祖细胞形成集落,同时与Epo、BPA、GM-CSF具有协同作用.人参皂甙对脐血细胞的细胞周期无影响,可抑制脐血细胞凋亡,该作用与PKC系统激活有关.由于肝的保存和再灌注损伤,大约15%～30%的患者出现移植后的最初无功能,成为肝移植后的主要死亡原因之一.因此,对于肝缺血/再灌注损伤的研究,已成为当代外科重视的课题.天津市第三中心医院通过建立大鼠原位肝移植后肝缺血/再灌注损伤模型,并行趋化因子MIP-2表达情况检测,证实在肝缺血/再灌注损伤中mRNA及血浆蛋白的高表达并与中性粒细胞浸润、肝损伤程度之间,具有正相关关系及其对中性粒细胞的趋化作用.该研究同时观察了预防肠源性内毒素血症所用的承气方剂,对上述病理变化的预防作用,为防治肝缺血/再灌注损伤提供了理论依据.

中国血浆蛋白制品的展望

血浆蛋白制品是从健康人血浆提取的用于临床治疗的生物制品,为多种疾病的必需药品。全球以美国、欧洲为首的血浆蛋白新制品的开发已呈全面且深入的状态,这对加快研发中国血浆蛋白新制品具有重要的启示意义。本文总结了国外已投入临床使用而中国尚未国产的血浆蛋白制品的研究现状,分析中国开发这类血浆蛋白制品难点并对其研发种类和应用前景作出展望。