基于Toll样受体4/核因子κB通路观察香烟烟雾溶液刺激对人支气管上皮样细胞相关基因表达的影响

目的 观察Toll样受体4(TLR4)基因沉默或过表达后香烟烟雾溶液(CSE)对人支气管上皮样细胞(16HBE)相关基因表达的影响。方法 2020年8—12月,用常规培养的人支气管上皮样细胞16HBE作为空白对照组,实验设干扰小RNA(siRNA)TLR4-1组(hs-TLR4-si-1+16HBE)、siRNA TLR4-2组(hs-TLR4-si-2+16HBE)、siRNA TLR4-3组(hs-TLR4-si-3+16HBE),另设阴性对照组(NC+16HBE),实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)筛选TLR4基因最佳沉默效果;自制CSE作用于16HBE,实验设常规培养的16HBE作为空白对照组、CSE组(CSE+16HBE)、siRNA TLR4组(CSE+hs-TLR4-si-2+16HBE)、siRNA TLR4-NC组(CSE+NC+16HBE)、Lv-TLR4组(CSE+Lv-TLR4+16HBE)、Lv-TLR4-NC组(CSE+Lv-TLR4-NC+16HBE),qRT-PCR检测TLR4、核因子κB(NF-κB)以及黏蛋白MUC5AC、MUC7、MUC8基因mRNA的表达。结果 与空白对照组相比,siRNA TLR4-2组TLR4 mRNA表达显著降低(1.00±0.22比0.47±0.04,P<0.05),因此选择hs-TLR4-si-2作为TLR4基因沉默的最佳siRNA。与空白对照组相比,CSE组TLR4(1.00±0.09比1.81±0.18)、NF-κB(1.00±0.04比1.65±0.11)、MUC5AC(1.00±0.12比2.09±0.24)、MUC7(1.00±0.20比2.21±0.26)、MUC8(1.00±0.11比1.75±0.06)mRNA表达均升高(均P<0.05);与CSE组相比,CSE+siRNA TLR4组TLR4(1.81±0.18比1.43±0.17)、NF-κB(1.65±0.11比1.12±0.05)、MUC5AC(2.09±0.24比1.38±0.13)、MUC7(2.21±0.26比1.46±0.30)、MUC8(1.75±0.06比1.23±0.03)mRNA表达均降低(均P<0.05),CSE+Lv-TLR4组TLR4(1.81±0.18比2.42±0.06)、NF-κB(1.65±0.11比1.94±0.07)、MUC5AC(2.09±0.24比2.56±0.19)、MUC7(2.21±0.26比2.72±0.33)、MUC8(1.75±0.06比2.10±0.10)mRNA表达均升高(均P<0.05)。结论 TLR4/NF-κB信号通路与CSE所产生的气道炎症有关,且其下游相关基因及黏蛋白表达受TLR4基因调控,TLR4的过度表达会加重CSE导致的气道炎症及慢性阻塞性肺疾病(COPD),抑制TLR4/NF-κB信号通路可在一定程度上减轻CSE所导致的气道炎症及COPD。

人支气管上皮样细胞中苯并[a]芘代谢物-DNA加合物图谱:基于染色质免疫共沉淀测序技术

[背景]苯并[a]芘(BaP)的活性代谢产物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)可与DNA加合,但BPDE-DNA加合物图谱尚不明确。[目的]采用染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-Seq),在全基因组水平上鉴定BPDE加合位点分布及加合基因,为深入研究BaP的毒作用机制提供依据。[方法]人支气管上皮样细胞16HBE培养至第四代达对数生长期。收获细胞并加入染色质免疫共沉淀裂解缓冲液,将裂解产物等分为实验组和对照组,实验组添加终浓度20μmol·L^(–1)的BPDE溶液,对照组添加相同体积的二甲基亚砜溶液,在37℃环境下孵育24 h。超声获得100~500 bp的染色质小片段。使用BPDE特异性抗体(anti-BPDE 8E11)富集与BPDE加合的DNA片段,高通量测序检测BPDE加合位点,使用MEME和DREME软件对前1000个峰序列进行模体分析,注释BPDE在全基因组水平的加合靶基因,并通过生物信息学技术对BPDE加合靶基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。[结果]高通量测序共检测出842个BPDE结合位点,在各染色体上均有分布。BPDE可以与基因编码区和非编码区共价结合,73.9%的结合位点分布在基因间区,19.6%分布在内含子区,上游2千碱基区域、外显子区、下游2千碱基区域及5′非翻译区也有少量分布。对前1000个峰序列进行分析,寻找到4条可靠的模体,发现富含鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的位点易于结合。对结合位点进行富集,共鉴定出199个BPDE加合靶基因,大多分布在1号、5号、7号、12号、17号和X染色体上。GO分析显示,靶基因主要富集于核酸和蛋白质结合,参与调节催化活性、转运活性、翻译延伸因子活性,在细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递方面发挥重要作用。KEGG分析显示靶基因主要富集于心血管疾病、癌症、免疫炎症反应等相关通路。[结论]利用ChIP-Seq在全基因组水平上共鉴定出199个BPDE加合靶基因,主要影响细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递等生物学功能,与心血管疾病、肿瘤及免疫炎症反应密切相关。

机械牵拉对人支气管上皮样细胞气道重塑相关因子表达的影响

本文为了研究机械牵拉人支气管上皮样细胞(16HBE)对转化生长因子-β1(TGF-β1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)表达的影响及其相关信号转导机制。采用柔性基底加载装置(FX-4000T)牵拉16HBE细胞,参数设置为拉伸幅度15%,频率1Hz,加载时间分别为:0.5h、1h、1.5h、2h。选择TGF-β1、FGF-2和Ca^(2+)表达较高的一组以经典瞬时感受器电位1(TRPC1)抑制剂SKF96365、蛋白激酶C(PKC)抑制剂HA-100干预。发现与空白对照组相比,4个时间段TGF-β1、FGF-2和Ca^(2+)的表达均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在0.5h时其增幅最大。对0.5h机械牵拉组予以SKF96365、HA-100干预,其TGF-β1、FGF-2和Ca^(2+)的表达均较0.5h机械牵拉组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。本文研究结果说明,机械牵拉16HBE细胞可导致气道重塑相关因子表达增加,PKC、TRPC1、Ca^(2+)可能参与了该信号通路。

虫草素抑制哮喘大鼠支气管上皮细胞间充质转化

目的考察虫草素(Cor)抑制哮喘大鼠上皮细胞间充质转化的作用机制。方法将大鼠随机分为4组(n=10):对照组、模型(OVA)组、OVA+10 mg/kg Cor组、OVA+50 mg/kg Cor组。治疗7 d后,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数,苏木精-伊红(HE)染色评价气道炎性反应和气道重塑程度,Masson三色染色检测上皮胶原沉积。将人支气管上皮样细胞16HBE分为3组:对照组、TGF-β1组和TGF-β1+Cor组。免疫荧光染色检测细胞中c-Jun的表达。CCK-8法和Transwell小室法检测细胞的增殖和迁移。免疫组织化学染色或Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、vimentin、Smad3、p-Smad3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平。结果与对照组相比,OVA组的胶原纤维面积和细胞计数显著增加(P<0.05);与OVA组相比,OVA+10 mg/kg Cor组和OVA+50 mg/kg Cor组的胶原纤维面积和细胞计数均减少(P<0.05)。与对照组相比,OVA组的E-cadherin的染色程度和蛋白表达水平均降低,而α-SMA的染色程度升高,N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平均升高(P<0.05);与OVA组相比,OVA+10 mg/kg Cor组和OVA+50 mg/kg Cor组的E-cadherin的染色程度和蛋白表达水平均升高,而α-SMA的染色程度降低,N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平均降低(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组的细胞活力和迁移细胞数均升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+Cor组的细胞活力和迁移细胞数均降低(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组的E-cadherin蛋白表达水平降低,而N-cadherin、α-SMA、vimentin、p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与TGF-β1组相比,TGF-β1+Cor组的E-cadherin蛋白表达水平升高,而N-cadherin、α-SMA、vimentin、p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表达水平均降低(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组的c-Jun的相对荧光强度升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+Cor组的c-Jun的相对荧光强度降低(P<0.05)。结论Cor通过抑制Smad3和ERK1/2信号通路及c-Jun抑制哮喘中的上皮细胞间充质转化(EMT)。

无机砷介导As3MT上调对16HBE细胞增殖、凋亡及AP-1表达的影响

目的了解无机砷(inorganic arsenic,i As)介导砷(+3氧化态)甲基转移酶[arsenic(+3 oxidation state)methyltransferase,As3MT]上调对16HBE细胞增殖、凋亡及激活蛋白-1(Activation of protein-1,AP-1)表达的影响,从而深入了解无机砷在细胞生物学中的作用机制。方法将16HBE细胞经体外培养后随机分成两大组:以不同浓度(0、2、4、6μmol/L)亚砷酸钠(sodium arsenite,NaAsO_(2))为一组和相同浓度(0、6、6、6μmol/L)一甲基砷酸(monomethylarsonic acid,MMA)、二甲基砷酸(dimethylarsinic acid,DMA)、NaAsO_(2)为一组染毒人支气管上皮样细胞(16HBE)48 h。Western Blot检测As3MT蛋白在细胞中的表达。通过小干扰RNA(small disturbance RNA,siRNAs)转染沉默As3MT可对染毒后细胞产生一系列生物学效应。CCK-8试剂盒来检测细胞活力,JC-1试剂盒检测早期细胞凋亡和HO/PI双染试剂盒检测晚期细胞凋亡和坏死。采取双萤光素酶报告基因检测转录因子AP-1的转录活性。Western Blot检测c-Jun(p-c-Jun)和c-Fos(p-c-Fos)的蛋白表达水平。结果实验发现,无机砷处理能够显著上调16HBE细胞中As3MT的表达水平,并对细胞的增殖和凋亡产生影响。与对照组相比,染毒后的16HBE细胞中As3MT表达随着NaAsO_(2)浓度的增加而增加,呈剂量-效应关系。相同浓度下,诱导As3MT表达的能力NaAsO_(2)>DMA>MMA。细胞转染技术提示,成功沉默As3MT。沉默As3MT后,CCK-8法显示细胞活力下降(NCmean=1.00,S1mean=0.94,S2mean=0.71),siAs3MTb1组细胞活力明显低于siCtrl组(P<0.05);siAs3MTb2组细胞活力明显低于siCtrl组(P<0.05)。JC-1检测提示细胞凋亡增加(NCmean=1.80,S1mean=1.40,S2mean=1.18),siAs3MTb 1组550 nm/485 nm比值明显低于siCtrl组(P<0.05);siAs3MTb2组550 nm/485 nm比值明显低于siCtrl组(P<0.05)。HO/PI双染提示细胞凋亡和坏死增加,siAs3MT组较siCtrl组细胞染色更为明显。双萤光素酶报告基因分析的结果AP-1活性上升(NCmean=48.83,S1mean=132.67,S2mean=163.83),siAs3MTb 1组AP-1转录活性明显高于siCtrl组(P<0.05);siAs3MTb2组AP-1转录活性明显高于siCtrl组(P<0.05)。Western Blot结果检测到沉默As3MT后c-Jun表达上升,p-c-Jun表达上升,c-Fos表达上升,p-c-Fos表达下调。结论本研究发现,无机砷可以显著上调As3MT的表达,对16HBE细胞的增殖、凋亡和AP-1表达产生了影响。进一步的实验表明,无机砷介导As3MT上调与AP-1通路有关。无机砷可能是通过调节As3MT的表达来影响细胞增殖、凋亡和转录因子表达的。

肺癌中热休克转录因子2促进热休克蛋白的表达

目的探讨HSF2通过促进热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的表达对肺癌发生以及肿瘤细胞增殖的影响.方法选取肺癌旁组织,构建过表达HSF2真核载体(p IRES2-EGFP-HSF2),分别转染BEAS-2B、A549,检测其对细胞增殖及HSP表达的影响;转染p IRES2-EGFP-HSF2质粒的同时,共转染HSP27、HSP90的si RNA,检测其对细胞增殖的影响.结果过表达HSF2可增加BEAS-2B和A549细胞增殖速度(P<0.01),促进HSP27和HSP90的表达;转染HSP27、HSP90的si RNA均可减弱HSF2诱导的BEAS-2B和A549细胞增殖(P<0.01).结论 HSF2促进肺癌细胞增殖的作用可能主要是通过促进热休克蛋白的表达来实现.

基于定量蛋白质组学技术的铬致细胞恶化转化中SET的潜在作用分析

目的分析六价铬[Cr(Ⅵ)]诱导人支气管上皮样细胞(16HBE细胞)恶性转化中蛋白表达谱改变及差异蛋白SET的表达水平,为研究Cr(Ⅵ)致癌的分子机制提供新的线索.方法以Cr(Ⅵ)诱导恶性转化的16HBE细胞为研究对象,提取总蛋白并经烷基化、脱盐,最后酶解为肽段,用Tandem Mass Tag(TMT)进行标记,利用液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)对标记肽段进行鉴定及相对定量;通过Western blot验证差异表达蛋白SET,并检测其下游分子的表达水平.利用在线分析网站Https://david.ncifcrf.gov对差异蛋白进行基因富集分析.结果 LC-ESI-MS/MS共鉴定3 517个蛋白,上调蛋白185个、下调蛋白201个;基因富集分析发现,差异蛋白主要参与细胞自噬、DNA损伤修复、RNA加工等多个生物学过程;Western blot结果显示,与对照组比较,SET蛋白表达水平上调(P<0.05),SET下游分子H3K18ac、H3K 27ac和p53的表达水平均呈下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 Cr(Ⅵ)诱导16HBE细胞恶性转化过程中涉及多个生物学过程的蛋白发生改变,SET可能通过抑制H3K18ac、H3K 27ac水平介导p53转录活性的调控模式在Cr(Ⅵ)致癌中发挥重要作用.