P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。

噻托溴铵对乙酰胆碱诱导的支气管上皮细胞NF-κB活化和IL-8表达的影响

目的观察噻托溴铵对乙酰胆碱诱导的支气管上皮细胞(16HBE)分泌IL-8及核转录因子NF-NF-κB活化的影响。方法使用不同浓度Ach、噻托溴铵和乙酰胆碱+噻托溴铵等分别处理生长良好的支气管上皮细胞(16HBE),用ELISA法检测细胞及其上清液中IL-8的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB蛋白含量变化。结果与对照组相比,乙酰胆碱能刺激16HBE分泌IL-8且呈剂量依赖,并在10 uM浓度时达到刺激高峰(P<0.001)。这种刺激作用与乙酰胆碱诱导16HBE的NF-κB活化有关(P<0.05)。噻托溴铵预处理可抑制乙酰胆碱诱导的NF-κB活性(P<0.05)及IL-8分泌(P<0.05)。结论噻托溴铵通过阻断NF-κB的活化,下调乙酰胆碱诱导16HBE细胞分泌IL-8水平,可能是其治疗COPD的抗炎作用机制之一。

苯并(a)芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及与组蛋白H2A单泛素化水平的关系

[目的]通过体外细胞培养途径,探讨苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,B[a]P)作用下人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化表达水平的关系。[方法]取对数生长期16HBE细胞,采用2μmol/L B[a]P染毒不同时间(0、1、2、4、8、12、24、48h)进行实验,用碱性单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾矩值(olivetail moments,OTM)评价DNA损伤程度;用Western-blot法检测组蛋白H2A单泛素化水平。[结果]单细胞凝胶电泳结果显示:2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各染毒组细胞DNA损伤程度均明显增高,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);Western-blot结果显示:2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,与对照组相比,组蛋白H2A的单泛素化水平增高,且在染毒2h后,差异有统计学意义(P<0.01);回归分析显示,单泛素化H2A的表达水平与DNA损伤程度存在高度相关,决定系数(R2)为0.910,P<0.01。[结论]B[a]P染毒致16HBE细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平之间存在密切关系。

单壁碳纳米管诱导人支气管上皮细胞的氧化损伤和凋亡

[目的]研究单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)对人源支气管上皮细胞株(BEAS-2B)氧化应激和细胞凋亡的影响。[方法]采用生长状态良好的BEAS-2B,分别以含0、10、50、100、200μg/mL SWCNTs的培养液处理24、48h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测SWCNTs对BEAS-2B细胞活力的影响;采用荧光探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)进行活性氧(ROS)检测;采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用可见光法测定过氧化氢酶(CAT)活性;采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)的含量;采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;采用阳离子荧光染料罗丹明123测定线粒体膜电位;采用pNA法检测细胞内caspase-3的蛋白活性;Real-time PCR测定细胞内bax和bcl-2基因的表达变化。[结果]当处理浓度大于10μg/mL时,SWCNTs可诱导BEAS-2B细胞存活率下降,细胞内ROS含量增加,线粒体膜电位减低,MDA升高,抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)酶活性降低,caspase-3蛋白活性增加,bax在转录水平上表达量增加,bcl-2表达量降低,各实验结果均呈效应随浓度变化的趋势(P<0.05)。[结论]SWCNTs能够诱导BEAS-2B细胞的氧化损伤和细胞凋亡。