自噬在α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化中的作用

目的:探讨自噬在α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化中的作用。方法:采用Western blot检测BEP2D细胞、α粒子作用BEP2D后的第24代细胞RH24以及α粒子作用BEP2D后的恶性转化细胞BERP35T-1(经鉴定为肺鳞癌细胞)内自噬相关蛋白LC3B-II、LC3B-I和P62的表达,透射电镜观察细胞内单位面积自噬小体的数量。分别用40和60μmol/L自噬抑制剂氯喹(CQ)及25 pmol/L自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)作用BERP35T-1细胞,采用Western blot法检测细胞内LC3B和P62蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞的存活率,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭数,划痕愈合实验检测细胞划痕闭合率。结果:与BEP2D细胞相比,RH24和BERP35T-1细胞内LC3B-II/I蛋白比值增高(P<0.05或P<0.01),P62蛋白表达降低,自噬小体数量增多(P<0.01)。40和60μmol/L的CQ分别作用BERP35T-1细胞48 h后,细胞内LC3B-II/I蛋白比值和P62蛋白表达水平均升高,细胞的存活率、侵袭数和划痕闭合率均降低(均为P<0.01);25 pmol/L的Rapa作用BERP35T-1细胞48 h后,细胞内LC3B-II/I蛋白比值升高,P62蛋白表达减弱,细胞的存活率、侵袭数和划痕闭合率均升高(P<0.05或P<0.01)。结论:在α粒子辐射诱发BEP2D细胞恶性转化过程中,细胞自噬增强,可能由此提高细胞的增殖、侵袭和迁移能力,从而促进细胞恶性转化。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

HSV-1突变株M6感染人支气管上皮细胞后对巨噬细胞介导的免疫反应的影响

目的探究1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)突变株M6感染人支气管上皮细胞(16HBE细胞)后对巨噬细胞介导的免疫反应的影响。方法用HSV-1感染16HBE细胞分析培养液中细胞因子的变化;将巨噬细胞与被HSV-1毒株感染的16HBE细胞的上清液共培养并通过尾静脉回输至小鼠体内,分别在第1、3、7、28、56、90天对小鼠淋巴结细胞因子表达水平、脾脏T细胞比例变化、小鼠中和抗体表达水平以及特异性T细胞反应进行检测。结果16HBE细胞被HSV-1突变株感染后,上清液中募集和激活巨噬细胞相关的细胞因子均较高水平表达但略低于野毒株组;尾静脉回输实验后,突变株组小鼠淋巴结炎症因子、趋化因子和T细胞的比例随时间发生了不同的变化,并引起了弱于野毒株组的体液免疫和强于野毒株组的特异性T细胞免疫反应,且仅极少数与野毒株组具有显著性差异(P<0.05)。结论16HBE细胞被HSV-1突变株M6感染后能够释放募集和激活巨噬细胞的细胞因子,使巨噬细胞携带HSV-1突变株的特异性活化信息,激活了宿主的免疫系统,诱导了宿主的体液免疫和细胞免疫。

铜绿假单胞菌感染支气管上皮细胞诱导铁死亡及丁酸钠的免疫调控作用

目的:探究铜绿假单胞菌(PA)感染对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)铁死亡与炎症反应的诱导作用及丁酸钠(NaB)对炎症的调节作用。方法:体外培养BEAS-2B细胞,加入不同浓度NaB后通过CCK-8筛选其安全浓度和作用时间,Westernblot检测酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)蛋白表达水平,确定NaB的用药条件。PA感染BEAS-2B细胞(MOI=1)不同时间后,CCK-8检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞线粒体形态变化,二价铁离子探针检测细胞内Fe^(2+)水平;加入NaB预处理后,BODIPY581/591C11荧光探针检测细胞内脂质过氧化水平,Westernblot检测ACSL4、P-AKT、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达水平;加入ACSL4抑制剂吡格列酮(PIO)后,Westernblot验证其抑制效果,ELISA检测各组细胞上清液中炎症因子水平变化。结果:NaB对BEAS-2B细胞的安全浓度在2.5mmol/L以下,2.5mmol/LNaB处理细胞36h后,ACSL4和P-AKT蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。PA感染BEAS-2B细胞后细胞存活率显著降低(P<0.05);细胞形态变为圆形;线粒体体积变小、膜密度增高,嵴减少甚至消失;胞内Fe^(2+)和脂质过氧化水平显著升高(P<0.05);细胞ACSL4和P-AKT蛋白表达水平上升(P<0.05),GPX4蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。NaB预处理细胞后,与PA组相比ACSL4和P-AKT蛋白的表达水平下降(P<0.05),对GPX4蛋白的降低及胞内脂质过氧化水平为促进作用。ELISA检测结果显示,与对照组相比,PA感染后IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平显著上升(P<0.05),IL-10水平轻微下降(P<0.05);NaB或PIO预处理后,IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平均显著下降(P<0.05),IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PA感染导致支气管上皮细胞内Fe^(2+)及脂质过氧化物的积累从而发生铁死亡并引起炎症反应,NaB可能通过抑制ACSL4和AKT磷酸化途径起到免疫调节作用。

甘草酸抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨甘草酸对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响,分析其机制是否与内源性酪氨酸激酶2(JAK2)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路有关。方法:将HBE细胞分为对照组、感染组(RSV组)、低剂量甘草酸组(RSV+L-甘草酸组)、中剂量甘草酸组(RSV+M-甘草酸组)、高剂量甘草酸组(RSV+H-甘草酸组)、RSV+Colivelin组、RSV+H-甘草酸+SD-1029组。对照组细胞不经任何处理;RSV组用含0.0001 PFU/mL的RSV病毒溶液培养细胞2h,再更换为正常培养液培养24h;RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组和RSV+H-甘草酸组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用30、60、120μg/mL甘草酸处理的培养基培养的细胞;RSV+Colivelin组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用含有浓度为0.5μmoL/L JAK2/STAT3信号通路激活剂Colivelin处理的培养基培养细胞;RSV+H-甘草酸+SD-1029组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用120μg/mL甘草酸和10μmoL/L JAK2/STAT3信号通路抑制剂SD-1029共同处理的培养基培养细胞。24h后收集细胞,CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α水平;western blot检测细胞中Bax、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况。结果:与对照组比较,RSV组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05);与RSV组比较,RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组、RSV+H-甘草酸组、RSV+Colivelin组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.05);与RSV+H-甘草酸组比较,RSV+H-甘草酸+SD-1029组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论:甘草酸可能通过激活JAK2/STAT3信号通路,促进RSV感染的支气管上皮细胞增殖,抑制RSV感染的支气管上皮细胞的凋亡。

PM_(2.5)有机提取物经由铁死亡诱导人支气管上皮细胞损伤的研究

目的探讨细颗粒物(PM_(2.5))有机提取物能否诱导人支气管上皮细胞铁死亡。方法通过索氏提取法提取PM_(2.5)中有机物作为受试物,使用BEAS-2B细胞,以0.1%DMSO溶液作为溶剂对照,染毒于不同剂量(2.5、5、10和20μg/mL)的PM_(2.5)有机提取物构建细胞染毒模型;使用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)构建铁死亡干预模型。通过吸光度法检测PM_(2.5)有机提取物染毒后BEAS-2B细胞存活率、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度;通过荧光法检测细胞内Fe2+含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和脂质过氧化物(lipid peroxidation,LPO)含量;通过qRT-PCR方法检测铁死亡相关基因(如GPX4、SLC7A11、ACSL4、FTL和TFRC等)表达。结果与对照组相比,PM_(2.5)有机提取物染毒24 h后,当染毒剂量为10μg/mL时,细胞内Fe2+含量、ROS含量、LPO含量和MDA浓度均出现显著上升;而GSH浓度出现显著下降;qRT-PCR结果显示,细胞暴露于20μg/mL PM_(2.5)有机提取物时,细胞内铁死亡相关基因GPX4显著下调,SLC7A11、ACSL4、FTL和TFRC出现显著性上调。干预实验中,使用铁死亡特异性抑制剂Fer-1干预后上述变化得到明显改善。结论PM_(2.5)有机提取物可能通过诱导细胞铁死亡导致呼吸系统细胞损伤,进而对肺组织产生潜在健康影响。

黄芪-桑白皮含药血清对人支气管上皮细胞炎症的影响

目的:探讨黄芪-桑白皮配伍对慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎症状态下人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)的影响。方法:制备大鼠含药(黄芪-桑白皮)血清,采用10%香烟烟雾提取物和20ng·mL-1脂多糖构建BEAS-2B细胞COPD炎症状态的模型,利用CCK8检测BEAS-2B细胞活力,Western blot法检测前期网络药理学预测的Caspase3、HIF-1α蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组BEAS-2B细胞活性降低(P<0.05),Caspase3、HIF-1α蛋白表达显著增多(P<0.05),提示COPD造模成功;与模型组比较,中药组BEAS-2B细胞活性升高(P<0.05),中药组Caspase3、HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:香烟烟雾及脂多糖可诱导BEAS-2B细胞中Caspase3、HIF-1α蛋白高表达,成功建立细胞模型。黄芪-桑白皮药对可明显抑制Caspase3、HIF-1α蛋白表达,初步揭示了黄芪-桑白皮药对通过抑制炎症反应、影响肺部细胞焦亡及氧化应激的反应等来治疗COPD。

克洛己新干混悬剂对LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用

目的 探讨克洛己新干混悬剂对脂多糖(LPS)诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用及其潜在机制。方法 将处于对数生长期的人支气管上皮细胞系BEAS-2B分为对照组(无干预)、LPS组(给予25μg/ml LPS)、克洛己新干混悬剂组(给予1 mg/ml克洛己新干混悬剂)和LPS+克洛己新干混悬剂组(分别给予25μg/ml LPS和1 mg/ml克洛己新干混悬剂)。分别采用CCK-8法观察细胞活性变化;流式细胞术测定细胞凋亡水平;Western印迹检测Toll样受体(TLR)4、下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核转录因子(NF)-κB的蛋白水平变化;DCFH-DA法检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-1β的蛋白水平。结果 LPS处理显著抑制BEAS-2B细胞活性,促进细胞发生凋亡,激活TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的活化(均P<0.05),还可显著增加细胞内ROS、TNF-α及IL-1β水平(均P<0.05)。同时给予细胞克洛己新干混悬剂治疗可显著逆转上述变化(均P<0.05),并可抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活(均P<0.05)。结论 克洛己新干混悬剂可能通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活,从而保护支气管上皮细胞减轻LPS诱导的炎症反应。

FGF23对支气管上皮细胞生长、免疫平衡和上皮间充质转化的影响

目的探究成纤维细胞生长因子23(FGF23)对支气管上皮细胞16HBE生长、免疫平衡和上皮间充质转化(EMT)的影响。方法使用Lipofectamine 3000转染试剂对16HBE细胞分别转染NC-shRNA或FGF23-shRNA。转染后,使用10 ng/mL TGF-β1处理细胞48 h。16HBE细胞分为对照组、NC-shRNA组、FGF23-shRNA组、TGF-β1组、NC-shRNA+TGF-β1组和FGF23-shRNA+TGF-β1组。通过CCK-8法检测细胞增殖。使用ELISA试剂盒检测16HBE细胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。通过qRT-PCR、Western blot或免疫荧光染色检测16HBE细胞中FGF23、Klotho、FGFR4、E-cadherin、α-SMA和N-cadherin的mRNA或蛋白表达水平。结果与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的OD 450nm值降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的IFN-γ和IL-10的水平升高,而IL-4和IL-17降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的E-cadherin蛋白表达水平升高,而α-SMA降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的E-cadherin相对荧光强度升高,而N-cadherin降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白表达水平均降低,而Klotho均升高(P<0.05)。结论下调FGF23抑制了TGF-β1诱导的16HBE细胞的生长和EMT过程,并纠正了Th1/Th2和Treg/Th17的失衡,FGF23-Klotho-FGFR4信号可能是哮喘治疗的一种分子靶标。

桑白皮汤含药血清调控人支气管上皮细胞黏液高分泌的机制研究

目的探究桑白皮汤调控人支气管上皮细胞黏液高分泌的机制。方法制备桑白皮汤含药血清和乙酰半胱氨酸溶液,采用15%香烟溶液和20 ng/mL脂多糖溶液对人支气管上皮细胞进行气道黏液高分泌造模,按照药物干预分为桑白皮汤组、乙酰半胱氨酸组、空白组及模型组,采用CCK-8法检测人支气管上皮细胞活性、电子显微镜下观察细胞形态及WB法检测数据挖掘中预测的白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达。结果实验显示,模型组与空白组对比,细胞活性降低,桑白皮汤组与模型组对比,细胞活性升高(P<0.05)。模型组与空白组对比,炎症细胞因子IL-1β、TNF-α蛋白表达明显增多(P<0.05),表明气道黏液高分泌造模成功。桑白皮汤组、乙酰半胱氨酸组与模型组对比,IL-1β、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论桑白皮汤含药血清可显著降低IL-1β、TNF-α蛋白表达,其治疗气道黏液高分泌的机制与调控炎症因子IL-1β、TNF-α有关。

LncRNA XIST调节miR-574-5p/TLR4轴对呼吸道合胞病毒感染的支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码(long non-coding,Lnc)核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)X-非活性特异性转录本(X-inactive specific transcript,XIST)调节微小RNA(microRNA,miR)-574-5p/Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)轴对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响。方法将人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,16HBE)分为阴性对照(negative control,NC)组、RSV感染(RSV infection,RSV)组、小干扰RNA阴性对照(small interfering RNA negative control,si-NC)组、XIST小干扰RNA(XIST small interfering RNA,si-XIST)组、siXIST+抑制剂阴性对照(inhibitor negative control,inhibitor-NC)组、si-XIST+miR-574-5p抑制剂(miR-574-5p inhibitor)组,实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNA XIST、miR-574-5p表达;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡;酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β的分泌;双荧光素酶报告基因实验验证miR-574-5p与LncRNA XIST和TLR4的关系;蛋白质印迹检测TLR4、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme 3,Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果相较于NC组,RSV组、si-NC组LncRNA XIST、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达升高,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达降低(P均<0.05);相较于si-NC组,si-XIST组LncRNA XIST表达、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达降低,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达升高(P均<0.05);下调miR-574-5p可逆转敲低LncRNA XIST对RSV感染的16HBE细胞凋亡和炎症反应的抑制(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-574-5p与LncRNA XIST、miR-574-5p与TLR4存在靶向调控关系(P<0.05)。结论LncRNA XIST在RSV感染的16HBE细胞中上调表达,敲低LncRNA XIST可能通过上调miR-574-5p来下调TLR4表达,抑制RSV感染后的16HBE细胞凋亡。

苦豆碱通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤

目的探究苦豆碱(Alo)对香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤的作用及其可能的作用机制。方法16HBE人支气管上皮细胞经100 mL/L香烟烟雾提取物(CSE)和(50、100、200)μmol/L Alo共处理后,CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、Western blot法检测细胞凋亡,ELISA检测炎性因子水平;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针和相关试剂盒检测氧化应激水平;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)通路相关蛋白表达水平。16HBE细胞经100 mL/L CSE和200μmol/L Alo共处理后,采用上述方法检测过表达TLR4对TLR4/NF-κB/NLRP3通路、细胞LDH活性、凋亡、炎症反应及氧化应激的影响。结果CSE暴露可降低16HBE细胞活力,增加LDH释放和细胞凋亡,增强炎症反应和氧化应激水平,且激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路;经Alo处理后,细胞活性升高,LDH释放减少、凋亡降低、炎症减轻、氧化应激水平下降,且TLR4/NF-κB/NLRP3通路失活;TLR4过表达可逆转Alo处理对CSE诱导的16HBE细胞损伤的保护作用。结论Alo可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路减轻CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤。

烟曲霉对人支气管上皮细胞DNA损伤和IL-33表达的影响及其机制

目的:探讨烟曲霉(Af)对人支气管上皮细胞DNA损伤和白细胞介素33(IL-33)表达的影响,阐明其相关作用机制。方法:采用不同浓度(1、5和10 mg·L^(-1))Af刺激支气管上皮BEAS-2B细胞,筛选合适的刺激浓度。采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Af刺激BEAS-2B细胞时,将细胞分为对照组、Af组、NAC组和Af+NAC组。采用DNA双链断裂修复抑制剂NU7441和Af刺激BEAS-2B细胞时,将细胞分为对照组、Af组、NU7441组和Af+NU7441组。采用彗星实验检测各组细胞彗星尾部DNA百分率,采用免疫荧光法检测各组细胞中DNA损伤相关蛋白磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达水平,采用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法检测各组细胞中活性氧(ROS)水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和白细胞介素25(IL-25)mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、磷酸化共济失调毛细血管扩张突变(p-ATM)和γH2AX蛋白表达水平。结果:与对照组比较,1 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平差异无统计学意义(P>0.05),5 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平明显升高(P<0.01);与5 mg·L^(-1) Af组比较,10 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平均明显升高(P<0.01)。与对照组比较,1 mg·L^(-1) Af组支气管上皮细胞中ROS水平明显升高(P<0.05);与1 mg·L^(-1) Af组比较,5 mg·L^(-1) Af组细胞中ROS水平明显升高(P<0.01);与5 mg·L^(-1) Af组比较,10 mg·L^(-1) Af组细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)。NAC处理后,与Af组比较,Af+NAC组细胞中彗星尾部DNA百分率(P<0.01)、γH2AX表达水平(P<0.05)和ROS水平(P<0.01)明显降低;NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中彗星尾部DNA百分率明显升高(P<0.01),γH2AX表达水平明显升高(P<0.01)。RT-qPCR检测,NAC处理后,与对照组比较,Af组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与Af组比较,Af+NAC组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显降低(P<0.05);NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。Westernblotting法检测,NAC处理后,与对照组比较,Af组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与Af组比较,Af+NAC组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:Af通过引起人支气管上皮细胞DNA损伤促进细胞中IL-33表达,其机制可能与激活ATM/NF-κB信号通路有关。

基于NF-κB通路研究芍药苷对LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用及机制研究

目的:探讨芍药苷通过调节NF-κB通路对脂多糖(LPS)诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用。方法:体外培养BEAS-2B细胞进行芍药苷毒性试验和浓度筛选。将BEAS-2B细胞分成正常对照组、LPS组、LPS+CAPE组、LPS+PF组和LPS+CAPE+PF组。使用LPS(1μg/ml)诱导BEAS-2B细胞炎症反应,按照不同分组给予芍药苷或NF-κB抑制剂CAPE干预,CCK-8检测细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA检测IFN-γ、IL-4、IL-17C、IL-10的水平,Western blot检测p53、Bcl-2、Bax、Cyclin1、NF-κB和p-p65的蛋白表达水平。结果:芍药苷能增加细胞活力,抑制细胞凋亡,提高IFN-γ和IL-10水平(P<0.01),降低IL-4和IL-17C水平(P<0.01),下调p53、Bax、NF-κB和p-p65蛋白表达水平(P<0.01),上调Bcl-2和Cyclin1蛋白表达水平(P<0.01)。NF-κB抑制剂CAPE干预后芍药苷作用效果更显著。结论:芍药苷可通过调控NF-κB通路降低LPS诱导的支气管上皮细胞炎症因子水平,从而抑制哮喘炎症反应。

钙结合蛋白S100A4抑制剂Niclosamide调节支气管上皮细胞炎症反应

目的:研究钙结合蛋白S100A4抑制剂Niclosamide对支气管上皮细胞炎症反应的潜在调控机制。方法:体外培养人支气管上皮细胞BEAS-2B,给予LPS刺激或Niclosamide预处理,RT-qPCR、Western blot检测相关细胞因子和信号分子表达,荧光探针检测细胞内ROS水平。结果:LPS刺激和Niclosamide预处理导致细胞ROS水平较对照组升高(P<0.05)。与对照组相比,LPS刺激导致支气管上皮细胞S100A4 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),相关信号通路分子TLR4/STAT3、MAPK1/3/SIRT1、NF-κB/IKKβ/p65 mRNA表达升高(P<0.05),炎症因子IL-1β和IL-6、紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA表达升高(P<0.05)。S100A4抑制剂Niclosamide预处理后,以上基因表达较LPS组呈不同程度下降(P<0.05),但TLR4/MAPK1、NF-κB/IKKβ/p65无明显变化(P>0.05)。Western blot结果显示:LPS组S100A4、STAT3、MAPK3/SIRT1、IL-1β和TNF-α蛋白表达较对照组明显升高(P<0.05),而Occludin表达较对照组降低(P<0.05)。Niclosamide预处理后S100A4、STAT3、MAPK3/SIRT1、IL-1β和TNF-α表达较LPS组降低(P<0.05),而Occludin表达较LPS组升高(P<0.05)。结论:钙结合蛋白S100A4抑制剂Niclosamide可抑制支气管上皮细胞S100A4表达并抑制其炎症反应,可能与STAT3、MAPK3/SIRT1信号相关。

活性氧簇/沉默信息调节因子1在高氧致支气管上皮细胞损伤中的作用

目的探讨活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)/沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)对高氧致BEAS-2B细胞线粒体损伤的影响。方法实验分为三部分:(1)细胞分为高氧0 h(H0)组、H6组、H12组、H24组、H48组。(2)细胞分为对照组、H48组、高氧48 h+SIRT1抑制剂(H48+EX 527)组和高氧48 h+SIRT1激动剂(H48+SRT1720)组。(3)细胞分为对照组、高氧48 h+乙酰半胱氨酸(H48+NAC)组和H48组。采用活性氧试剂盒检测ROS水平,Western blot法检测SIRT1和线粒体相关蛋白表达水平,免疫荧光染色法检测线粒体相关蛋白表达,透射电镜检测线粒体形态。结果(1)与H0组相比,H6组、H12组、H24组和H48组ROS荧光强度增加(P<0.05),H48组SIRT1和线粒体相关蛋白表达水平降低(P<0.05),H24组和H48组线粒体相关蛋白荧光强度降低(P<0.05)。(2)与H48组相比,H48+SRT1720组线粒体相关蛋白表达水平升高,线粒体平均长宽比增加(P<0.05);H48+EX 527组线粒体平均面积减少(P<0.05)。(3)与H48组相比,H48+NAC组ROS荧光强度降低,SIRT1和线粒体相关蛋白表达水平升高,线粒体平均面积和平均长宽比增加(P<0.05)。结论ROS/SIRT1轴参与了高氧诱导的BEAS-2B细胞线粒体损伤。

柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症因子及HMGB1/TLR4/NF-κB的影响

目的探讨柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)及下游炎症介质单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法将小鼠支气管上皮细胞分为对照组(Con组,空白血清培养)、Model组(哮喘小鼠血清培养)和Chaipu组(柴朴汤药血清培养)。采用qRT-PCR和Western blotting检测小鼠支气管上皮细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6的mRNA及蛋白表达情况,ELISA法测定细胞培养液中MCP-1和IL-6的水平。结果与Con组相比,Model组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6表达均明显升高(P<0.05);Model组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著升高(P<0.05)。与Model组相比,Chaipu组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、MCP-1、IL-6 mRNA和蛋白表达降低,NF-κB m RNA表达亦降低(P<0.05);Chaipu组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著降低(P<0.05)。结论柴朴汤可下调哮喘血清诱导的炎症因子的表达,可能与其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB炎症通路有关。

lncRNA OIP5-AS1靶向miR-7-5p对LPS诱导的人支气管上皮细胞损伤的影响

小儿哮喘是临床常见的一种疾病类型,由支气管上皮细胞损伤与功能障碍导致,在外界刺激性物质作用下支气管上皮细胞结构及功能被破坏而产生炎症因子,炎症因子大量释放与细胞凋亡数量增加是引起哮喘患儿支气管上皮细胞损伤的重要原因,目前人支气管上皮细胞损伤的分子机制尚未完全阐明[1-2]。研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在重症哮喘患者中表达异常,并可能参与哮喘的形成机制,还可调节支气管上皮细胞凋亡、炎症等生物学过程[3-4]。lncRNA OIP5-AS1在屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中表达升高,并可通过miR-143-3p/HMGB1轴促进屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞炎症反应[5]。本研究通过生物信息学预测发现OIP5-AS1与miR-7-5p存在结合位点。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人支气管上皮细胞建立细胞损伤模型,探讨OIP5-AS1/miR-7-5p分子轴在人支气管上皮细胞损伤发生过程中的作用机制。

上皮-间充质转化在高氧诱导大鼠支气管肺发育不良模型中的作用及机制研究

目的探讨上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在大鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型中的作用及机制。方法实验分为两部分。(1)将48只早产大鼠随机分为常氧组和高氧组,每组24只。高氧组暴露于85%氧气中建立早产大鼠BPD模型,常氧组置于同一室内常压空气中,于实验第1、4、7、14天收集早产大鼠肺组织标本。(2)将大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系(RLE-6TN)随机分为常氧组(常规空气中培养)和高氧组(在95%氧气中培养),分别于高氧暴露后12 h、24 h、48 h收集细胞标本进行检测。使用苏木精-伊红染色法观察早产大鼠肺泡化情况,免疫荧光检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞肺表面活性蛋白C(surfactant protein C,SPC)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的共定位。实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞EMT相关mRNA和蛋白表达水平。结果(1)与常氧组相比,高氧暴露7 d开始高氧组早产鼠可见肺泡化阻滞和肺泡结构简单化改变;肺组织中SPC和α-SMA存在明显共定位现象,高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。(2)高氧暴露24 h、48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。结论EMT破坏了BPD早产大鼠肺泡上皮细胞之间的紧密连接,造成肺泡结构简单化和发育异常,参与了BPD的发生发展。

尘螨经PI3K通路对人支气管上皮细胞和血管内皮生长因子表达的影响及可能的调控机制

目的探讨尘螨经PI3K通路对人支气管上皮细胞(16-HBE)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及可能的调控机制。方法培养16-HBE细胞,根据不同尘螨刺激浓度和10μmol/LLY294002分为正常对照组、尘螨100 U/L组、尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、尘螨2000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组。采用四唑盐(MTT)比色法检测不同尘螨浓度的16-HBE活力,再检测LY294002组、LY294002+尘螨400 U/L组及正常对照组16-HBE活力,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测量不同条件刺激下16-HBE的VEGF mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测不同条件刺激下16-HBE的VEGF蛋白水平。结果尘螨2000 U/L组细胞活力低于正常对照组、尘螨100 U/L组、尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600U/L组、尘螨800U/L组及尘螨1000 U/L组(P<0.05)。LY294002组、LY294002+尘螨400 U/L组、正常对照组16-HBE活力比较差异无统计学意义。正常对照组VEGF(165)mRNA表达水平低于尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组,尘螨200U/L组低于尘螨400U/L组,高于LY294002+尘螨400U/L组、LY294002组,尘螨400U/L组高于尘螨600U/L组、尘螨800U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组均高于LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨400 U/L+LY294002组高于LY294002组(P<0.05)。正常对照组16-HBE培养上清VEGF蛋白水平低于尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800U/L组、尘螨1000U/L组、尘螨400U/L+LY294002组,尘螨200 U/L组低于尘螨600 U/L组,高于尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨400 U/L组高于尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组均高于尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组均高于LY294002组(P<0.05)。结论尘螨经PI3K通路16-HBE在VEGF mRNA和蛋白水平上的高表达,其机制可能是经由PI3K与哮喘密切相关信号通路,为尘螨导致哮喘的可能机制提供新线索,可为哮喘的治疗带来新思路。