防风-乌梅含药血清对血小板衍生因子诱导人支气管平滑肌细胞增殖与细胞周期的影响机制研究

目的观察防风-乌梅含药血清对血小板衍生因子(PDGF)诱导人支气管平滑肌细胞(HBSMC)增殖及其对细胞周期的抑制作用,探索防风-乌梅配伍抑制气道重塑的机制。方法通过PDGF诱导的方式诱导HBSMC增殖;分别予大鼠灌胃防风、乌梅、防风-乌梅及生理盐水,制备药物血清;取4代对数生长期的HBSMC,将其分为空白对照组、细胞模型组、正常大鼠血清组、正常大鼠血清细胞模型组、激素干预组、防风血清组、乌梅血清组、防风-乌梅血清组,对细胞给予相应处理;CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞检测细胞周期,Elisa技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)的浓度。结果防风-乌梅血清组降低细胞增殖的能力要优于单独使用防风血清组和乌梅血清组;防风-乌梅血清组能增加G0/G1期细胞比例,减少S期细胞数;防风-乌梅血清组降低TNF-α和IL-8浓度的作用优于单独使用防风血清组和乌梅血清组。结论防风-乌梅配伍能显著抑制HBSMC增殖,阻滞细胞周期进程,影响气道重塑,其机制可能通过抑制TNF-α、IL-8释放有关。

瞬时受体电位香草酸亚型1通道影响支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症的研究

目的探讨瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道对支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症的影响。方法 2013年6月—2014年6月,选取5～6周龄清洁级健康雄性SD大鼠60只,采用随机数字表法分为：正常对照组、支气管哮喘组、支气管哮喘＋辣椒素（CAP）组、支气管哮喘＋辣椒卓平（CPZ）组,每组15只。支气管哮喘组、支气管哮喘＋CAP组、支气管哮喘＋CPZ组大鼠制作支气管哮喘模型,支气管哮喘＋CAP组大鼠给予含有0.01%CAP的饲料喂养,支气管哮喘＋CPZ组大鼠给予含有0.01%CPZ的饲料喂养。病理学检查显微镜下找到完整肺内支气管横断面,计算管壁面积（WA）/管腔内周长（Pi）、支气管平滑肌面积（S）/Pi、支气管平滑肌细胞核数（N）/Pi,采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）和Western blotting法检测气管平滑肌组织TRPV1、增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA及其蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠气管平滑肌组织白介素（IL）-4、IL-5、IL-13表达水平。结果支气管哮喘组和支气管哮喘＋CAP组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于对照组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CAP组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于支气管哮喘组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CPZ组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi低于支气管哮喘＋CAP组（P〈0.05）。支气管哮喘组和支气管哮喘＋CAP组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平高于对照组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CAP组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平高于支气管哮喘组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CPZ组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平低于支气管哮喘和支气管哮喘＋CAP组（P〈0.05）。结论 TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13在支气管哮喘大鼠气管平滑肌组织中高表达,阻断TRPV1通道后,气管平滑肌组织增生和炎症均明显减轻,提示TRPV1通道可能在支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症形成中发挥重要作用。

细胞外信号调节激酶活化在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用(英文)

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(airwaysmooth muscle cells, ASMCs)增殖中的作用。建立慢性哮喘大鼠模型,用 ERK 激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和抑制剂 PD98059 干预慢性哮喘大鼠 ASMCs 的培养。采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、3H-thymidine (TdR)掺入法和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)免疫组织化学法检测ASMCs增殖情况,观察ERK信号通路对ASMCs 增殖的影响。RT-PCR 和 Western blot 检测 ERK mRNA 和 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2 (p-ERK1/2)蛋白的表达。与正常对照组ASMCs 比较,慢性哮喘组ASMCs 的 G0/G1 期细胞所占比例明显减少,S+G2/M 期细胞所占比例增高;吸光度(A490)值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量均明显增加,ERK mRNA、ERK1/2 蛋白、p-ERK1/2 蛋白的表达量以及ERK 活化率显著增高。经PD98059 干预之后,慢性哮喘组ASMCs 的 S+G2/M 期细胞所占比例、A490 值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1/2 蛋白、p-ERK1/2 蛋白的表达量以及ERK 活化率显著降低。经EGF 干预后,慢性哮喘组ASMCs 的 S+G2/M 期细胞所占比例、A490 值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059 抑制。以上结果提示,慢性哮喘大鼠ASMCs 内源性增殖活性增加,ERK1/2 参与其增殖活性的调控,ERK 信号通路在哮喘气道重建的ASMCs 增殖调控中具有重要作用。

麻黄碱抑制支气管平滑肌细胞增殖的机制

BK通道(large-conductance Ca2+-activated K+ channel)是一种大电导、电压和钙离子依赖的钾通道,存在于哺乳动物几乎所有的组织中。β1亚基是首次从平滑肌细胞中分离到的一种BK通道辅助亚基。麻黄作为一种β肾上腺素受体激动剂,是一味治疗哮喘的常用中药。利用RT-PCR和膜片钳等技术,研究麻黄治疗哮喘的作用机制。结果表明:麻黄碱(ephedrine,Eph)作为麻黄的一种主要成分,显著抑制支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)的增殖和BK通道β1亚基的表达,但是对BK通道的电流没有显著影响。

JAK/STAT3信号通路参与白细胞介素-17诱导的支气管平滑肌细胞增殖与迁移

【目的】探讨白介素-17(IL-17)促进支气管平滑肌细胞(BSMC)的增殖与迁移作用及JAK/STAT3相关信号通路在其中的作用机制。【方法】使用不同浓度IL-17处理BSMC不同时间,以确定最佳实验条件。随后使用MTT检测细胞活力,BrdU染色观察细胞增殖状态,并使用PI染色流式细胞仪检测细胞周期。进一步利用细胞迁移实验检测细胞迁移能力。使用Western blot实验检测IL-17处理后BSMC的JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3蛋白表达量。利用JAK/STAT3信号通路特异性阻断剂AG490来特异性阻断JAK/STAT3信号通路,检测阻断JAK/STAT3信号后IL-17对细胞增殖、迁移以及JAK/STAT3信号通路蛋白表达量的影响。【结果】IL-17可促进BSMC增殖(P <0.05),促进细胞周期进程(P <0.05)并使细胞迁移能力增强(P <0.05)。这一过程伴随着BSMC的JAK/STAT3信号通路的增强(P <0.05)。抑制JAK/STAT3信号通路缓解了IL-17对BSMC的促进增殖和迁移的作用(P <0.05)。【结论】JAK/STAT3信号通路参与了IL-17诱导的BSMC增殖与迁移作用,AG490对IL-17引起的BSMC JAK/STAT3信号通路的增强起到了抑制作用。

核因子κB在支气管哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨核因子κB(NFκ-B)在支气管哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用。方法采用卵清蛋白(OVA)致敏OVA激发的方法制备大鼠哮喘模型。将18只Wistar大鼠分为:①哮喘组;②吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组:OVA激发前腹腔注射NFκ-B的特异性抑制剂PDTC(100 mg/kg);③对照组:注射及吸入等量生理盐水。采用流式细胞术、MTT法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光技术等方法观察ASMCs增殖;免疫荧光技术及电泳迁移率改变分析(EMSA)检测NFκ-B活性;Western blot检测NFκ-B的抑制蛋白I-κBα表达。结果①PDTC组ASMCs S期比例、A值、PCNA阳性表达率分别为(11.77±3.37)%、(0.283±0.034)、(27.9±6.7)%,与哮喘组[(22.17±3.64)%、(0.469±0.050)、(77.3±8.4)%]比较均显著降低(均P<0.05),与对照组[(12.08±2.86)%、(0.302±0.059)、(25.3±3.8)%]比较差异均无显著性意义(均P>0.05)。②PDTC组ASMCs NFκ-B活性与哮喘组比较显著降低(P<0.05),与对照组比较差异无显著性意义。结论NF-κB参与哮喘大鼠ASMCs增殖,抑制NF-κB活性能降低哮喘大鼠ASMCs增殖。

磷脂酰肌醇3激酶和细胞外调节蛋白激酶信号通路对支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖的协同调控作用

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路对支气管哮喘（简称哮喘）大鼠气管平滑肌细胞（ASMC）增殖的协同调控作用。方法 6~8周龄SPF级雄性SD大鼠,复制大鼠慢性哮喘模型,离体培养大鼠气管ASMC,将细胞分为正常组、哮喘组、转化生长因子β1（TGF-β1）组、TGF-β1＋PD98059组、TGF-β1＋渥曼青霉素（wortmannin）组、TGF-β1＋PD98059＋wortmannin组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况及Western blotting法检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）表达情况。结果 CCK-8法检测各组大鼠ASMC OD值,TGF-β1组高于正常组和哮喘组,TGF-β1＋PD98059组、TGF-β1＋wortmannin组和TGF-β1＋PD98059＋wortmannin组低于TGF-β1组,TGF-β1＋PD98059＋wortmannin组低于TGF-β1＋PD98059组和TGF-β1＋wortmannin组（P〈0.01）。Western blotting法检测ASMC中p-Akt的表达,哮喘组高于正常组,TGF-β1组高于哮喘组,TGF-β1＋wortmannin组低于TGF-β1组（P〈0.01）。Western blotting法检测ASMC中p-ERK1/2的表达,哮喘组高于正常组,TGF-β1组高于哮喘组,TGF-β1＋PD98059组低于TGF-β1组（P〈0.01）。结论 PI3K和ERK信号通路协同调控了TGF-β1刺激哮喘大鼠ASMC增殖过程。

周期蛋白D1在香烟提取物促进支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的观察支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclinD1)的表达变化,探讨cyclinD1在香烟提取物(CSE)促进哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法 16只SD大鼠随机分为对照组(n=8)和哮喘组(n=8)。原代培养大鼠ASMCs,分为对照组(A组)、对照+CSE组(B组)、哮喘组(C组)、哮喘+CSE组(D组)、哮喘+CSE+pcDNA3.1组(E组)和哮喘+CSE+pcDNA3.1-ascyclinD1组(F组)。检测ASMCs增殖及cyclinD1 mR-NA、蛋白表达情况。结果 ASMCs增殖水平及cyclinD1 mRNA、蛋白表达水平比较,A组与C组,C组与D组,D组与F组间均有统计学差异(P均<0.01)。结论正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclinD1表达明显增加。CSE可能是通过cyclinD1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。

露蜂房蛋白抑制大鼠支气管平滑肌细胞体外增殖的可能机制

目的观察露蜂房蛋白[NVP(1)]对大鼠支气管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法用原代细胞培养、MTT法、流式细胞术和免疫印迹法检测细胞增殖。结果6.4×10-3g/L的NVP(1)明显抑制支气管平滑肌细胞增殖,并且阻断在细胞周期的G1期(对照组G1期为64.6%,NVP(1)处理组为90.5%)。NVP(1)能增强细胞周期蛋白激酶抑制剂(P21)蛋白的表达,降低细胞周期蛋白激酶(cdk2)蛋白的表达。结论NVP(1)阻断支气管平滑肌细胞增殖于细胞周期的G1期。

射麻止喘汤对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞增殖的影响

【目的】观察射麻止喘汤对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响。【方法】选用SPF级SD大鼠分为哮喘组和正常对照组,哮喘组采用卵清蛋白(OVA)致敏并激发方法复制哮喘模型,造模成功后分别取各组支气管平滑肌进行细胞培养,倒置显微镜观察形态并经免疫荧光染色鉴定;给予大鼠灌胃高、中、低剂量的射麻止喘汤(剂量分别为64、32、6.4 g.kg-1.d-1)制备含药血清;取2～5代ASMC分别给予射麻止喘汤高、中、低剂量含药血清,蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波醇-12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA,10 nmol/L),PKC抑制剂马来酰亚胺甲磺酸盐(Ro-31-8220,5μmol/L)干预;另设空白组(不给予任何药物血清干预)。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组ASMC增殖(D值)。【结果】免疫荧光染色鉴定结果显示所培养的细胞为平滑肌细胞。正常大鼠PMA组ASMC的D值较空白组显著增高(P<0.05),Ro-31-8220组、射麻止喘汤各剂量组D值与空白组比较差异均无显著性意义(P>0.05)。哮喘模型大鼠PMA组ASMC的D值较空白组显著增加(P<0.05),Ro-31-8220组、射麻止喘汤各剂量组D值均较空白组显著降低(P<0.05),但射麻止喘汤各剂量组与Ro-31-8220组比较差异无显著性意义(P>0.05)。【结论】射麻止喘汤治疗支气管哮喘的作用可能与其能抑制ASMC增殖,影响哮喘的气道重塑过程有关。

不同产地前胡对氧化应激后支气管平滑肌细胞增殖影响研究

目的:探讨H2O2氧化应激刺激后,前胡有效成分及不同产地前胡粗提物干预对支气管平滑肌细胞(HBSMSCs)增殖影响。方法:检测不同产地前胡药材中前胡甲素及乙素含量。利用CCK-8分别对前胡甲素、前胡乙素单体及不同产地前胡粗提物对H2O2诱导支气管平滑肌增殖的影响进行考察。结果:HBSMSCs用25μM H2O2作用24h后,白花前胡甲素在12.5、25、50μM浓度下对其增殖有较明显的抑制作用,且与空白对照0μM相比,差异有统计学意义。而白花前胡乙素抑制作用较弱,差异无统计学意义(P>0.05)。通过比较12个产地前胡提取物对于HBSMSCs增殖的抑制作用,发现来自浙江淳安、浙江临安昌化、浙江磐安和安徽宁国4个产地的抑制作用最佳。结论:道地产区浙江和安徽的前胡药材对于支气管平滑肌细胞增殖有较好的抑制作用,具有较好的消除气道炎症的效果。

YKL-40调控支气管上皮分泌IL-8对支气管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:研究YKL-40介导支气管上皮细胞的炎症反应及对支气管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。方法:体外培养支气管上皮永生细胞系(BEAS-2B)和原代人支气管上皮细胞(HBECs),用不同浓度的YKL-40刺激BEAS-2B和HBECs不同时间后,用Realtime PCR和ELISA方法检测炎症细胞因子的变化。YKL-40刺激BEAS-2B和HBECs 6 h后,更换新鲜培养基继续培养18 h后收集细胞培养液,命名为(YKL-40-BEAS-2B-CM、YKL-40-HBECs-CM),用于培养支气管平滑肌细胞(BSMCs)。24 h后检测BSMCs迁移能力的变化,72 h后检测BSMCs增殖能力的变化。结果:在BEAS-2B和HBECs中,YKL-40均能以浓度和时间依赖方式增强IL-8 mRNA的表达和IL-8的分泌,但对RANTES、Eotaxin,TNF-α没有影响。YKL-40-BEAS-2B-CM和YKL-40-HBECs-CM刺激BSMCs能显著增强其增殖能力和迁移能力,但去除YKL-40-BEAS-2B-CM和YKL-40-HBECs-CM中的IL-8后,则未见其可以明显提高BSMCs的增殖和迁移能力。结论:YKL-40通过调控支气管上皮表达和分泌IL-8参与了哮喘时的气道炎症反应,进一步通过影响支气管平滑肌细胞的增殖和迁移介导哮喘时的气道重构。抑制IL-8有望成为控制YKL-40介导的哮喘炎症反应和组织重构的有效干预措施。

氯沙坦通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信号通路调节高糖诱导的血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨氯沙坦(LT)通过肌醇需求酶(IRE)1-肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2-凋亡信号调节激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、凋亡和迁移的影响。方法 取对数生长期VSMCs,并分组为空白组、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高糖+LT组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT)、高糖+毒胡萝卜素(TG)组(25 mmol/L葡萄糖+0.2 nmol/L IRE1α激动剂TG)、高糖+LT+TG组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT+0.2 nmol/L TG)。流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell及划痕实验检测细胞迁移;细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测细胞增殖;Western印迹检测IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路相关蛋白表达水平。结果 与空白组相比,高糖组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+LT组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著降低,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),但高糖+TG组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);TG逆转了LT对高糖诱导的VSMCs增殖、凋亡和迁移的作用(P<0.05)。结论 LT可以抑制高糖诱导的VSMCs增殖和迁移,促进其凋亡,可能与抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有关。

改变PTEN基因表达影响支气管平滑肌细胞增殖

目的:通过基因过表达和RNA干扰(RNAi)技术改变PTEN基因的表达并观察其对人支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖和相关信号通路的影响。方法:利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN),转染BSMC细胞,建立PTEN基因过表达细胞模型Ad-GFP-PTEN-BSMC和PTEN基因沉默细胞模型Ad-GFP-shPTEN-BSMC,并以感染Ad-GFP和空白组作为对照。通过荧光倒置显微镜检测转染效率;Westernblot法检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况;MTS/PMS法检测细胞生长的变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:腺病毒介导的过表达载体和shRNA载体都能有效改变PTEN基因的表达。PTEN基因表达上调后,BSMC细胞生长受到抑制,G0-G1期细胞增多,S期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路受到抑制,而MAPK/ERK通路未见变化;PTEN基因表达下调后,BSMC细胞生长受到促进,S期细胞增多,G0-G1期细胞和G2/M期细胞减少,PI3K/AKT通路激活,但MAPK/ERK通路却受到抑制。结论:PTEN基因可能主要通过调节PI3K/AKT通路影响人支气管平滑肌细胞的生长。

虎杖苷调节YAP1/TAZ信号通路对缺氧性肺动脉高压新生大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究虎杖苷(PD)对缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法 将新生大鼠随机分为6组:对照组、模型组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+Hippo通路抑制剂(PD高剂量+XMU-MP-1)组,每组10只。缺氧2周后,检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,并计算肺动脉管壁厚度占总厚度的百分比(WT%)和管壁面积占总面积的百分比(WA%)。分离各组新生大鼠PASMCs,分为NC组、低氧(Hypoxia)组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+XMU-MP-1组。CCK-8和EdU检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹(Western blot)检测肺组织和PASMCs中Yes相关蛋白1(YAP1)、PDZ结合域的转录共刺激因子信号通路(TAZ)、哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠肺动脉管壁明显增厚,管腔变窄,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组相比,PD低、中、高剂量组大鼠肺动脉增厚减少,管腔变大,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著降低,且PD各组间差异存在剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。与NC组相比,Hypoxia组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著升高,凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(均P<0.05);与Hypoxia组相比,PD低、中、高剂量组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax表达显著升高,且PD各组间有剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。结论 PD可能通过抑制YAP1/TAZ信号通路抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促进凋亡。

Nrf2调控的氧化应激在Adropin抑制低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用研究

目的 观察Adropin对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及氧化应激的影响,并探讨其可能机制。方法 以1%的O_(2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖及氧化应激的细胞模型,通过活性氧(ROS)激活剂H_(2)O_(2),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及不同浓度Adropin(100、300、1000 nmol·L^(-1))干预24 h后,检测细胞增殖及ROS,筛选Adropin抑制增殖及氧化应激的最适浓度。选择1000 nmol·L^(-1) Adropin和/或核因子E2相关因子2(Nfr2)抑制剂ML385在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,并设置Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)作为阳性对照组,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖;DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS的水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测Nrf2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E的表达。结果 与对照组相比较,H_(2)O_(2)及低氧均能够诱导PASMCs增殖及ROS生成,而不同浓度的Adropin(100、300、1000nmol·L^(-1))和NAC均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖及ROS产生,且Adropin抑制增殖及ROS产生具有浓度依赖性。与低氧组相比较,DMF或Adropin(1000 nmol·L^(-1))干预后,PASMCs增殖及细胞内ROS水平下降,SOD、GPx、CAT活性增加,MDA水平下降,Nrf2表达上调(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin的上述作用(P<0.05);DMF或Adropin能够通过抑制Cyclin D1与Cyclin E的表达,阻滞细胞周期于G_(0)/G_(1)期,从而抑制PASMCs增殖(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin上述作用(P<0.05)。结论 Adropin可通过抑制氧化应激抑制低氧诱导的PASMCs增殖,其机制可能与激活Nrf2有关。

马鞭草苷通过NF-κB/MAPK信号通路干预支气管哮喘大鼠气道炎症、气道平滑肌细胞增殖及RhoA表达的研究

目的:探究马鞭草苷对支气管哮喘大鼠气道炎症、气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖、Rho A表达及NF-κB/MAPK信号通路的影响。方法:72只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组和马鞭草苷高、中、低剂量组,每组12只。除对照组外,其余大鼠采用卵清白蛋白致敏法制备支气管哮喘模型,各组大鼠于模型制备成功次日开始接受药物灌胃治疗。记录各组大鼠支气管灌洗液中炎症细胞种类及计数情况,HE染色观察各组大鼠肺组织病理学变化,采用流式细胞仪检测细胞周期,采用PCR与Western blotting法检测大鼠肺组织Rho A表达水平,并分析马鞭草苷的作用机制。结果:与对照组比较,模型组大鼠支气管灌洗液中巨噬细胞水平明显降低(P<0.05),淋巴细胞、中性粒细胞、白细胞水平明显升高(P<0.05);S期细胞占比明显升高(P<0.05);Rho A表达水平明显上调(P<0.05);NF-κB/MAPK信号通路活性明显增加(P<0.05)。与模型组比较,马鞭草苷各剂量组和地塞米松组大鼠支气管灌洗液中炎症细胞计数明显减少(P<0.05),巨噬细胞水平明显增加(P<0.05);Rho A表达水平明显下降(P<0.05);NF-κB/MAPK信号通路活性明显降低(P<0.05)。结论:马鞭草苷可以减轻支气管哮喘大鼠气道炎症,抑制气道平滑肌细胞过度增殖,降低Rho A基因与蛋白表达水平,其具体机制可能涉及抑制NF-κB/MAPK信号通路活性。

细胞外信号调节激酶1／2信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞迁移功能变化中的调控作用

本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)迁移能力改变中的调控作用。应用卵清蛋白致敏和雾化方法制备大鼠慢性哮喘模型,体外培养大鼠BSMCs,采用免疫荧光细胞化学、Western blot和RT-PCR方法检测ERK1／2信号通路的表达,分别用平面迁移实验和跨膜迁移实验来评价BSMCs的活动和趋向迁移能力,并比较用和不用ERK1／2信号通路干预剂的差异。Western blot结果显示慢性哮喘模型大鼠BSMCs中总ERK1／2(9．13±0．87)较对照组(4．68±0．59)明显增加,磷酸化ERK1／2(p-ERK1/2)占总ERK1／2的比值(0．55±0．05)较对照组(0．48±0．04)显著提高(n=10,P<0．01)。慢性哮喘组ERK1和ERK2 mRNA的表达(1．83±0．24和1．07±0．11)较对照组(0．58±0．14和0．51±0．12)明显增高(n=10,P<0．01)。在平面迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的迁移最远距离是对照组的(2．9±0．1)倍,在ERK1／2激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激下增加到(5．0±0．2)倍,而在30μmol／L PD98059的作用后下降到(1．7±0．2)倍。正常对照大鼠BSMCs平面迁移能力对PD98059的反应较慢性哮喘组弱,仅在100μmol／L PD98059的作用下下降到(0．8±0．1)倍。跨膜迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的跨膜迁移细胞是对照组的(1．9±0．1)倍,在EGF刺激下增加到(3．1±0．2)倍,而在30μmol/L PD98059作用后下降到(1.45±0.2)倍。这些结果表明慢性哮喘模型大鼠BSMCs的迁移能力明显增强,ERK1／2信号通路在该功能变化的调控中可能发挥了重要作用。

白细胞介素18经toll样受体4/髓样细胞分化因子88/核转录因子-κB通路促进支气管平滑肌细胞增殖与迁移

目的 探讨白细胞介素18 (IL-18)经toll样受体4 (TLR4)/髓样细胞分化因子88 (MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)通路促进支气管平滑肌细胞(BSMC)增殖与迁移。方法 采用不同浓度IL-18、不同时间处理BSMC,确定实验条件。细胞计数试剂盒(CCK-8)测定细胞活性,Transwell小室检测细胞迁移,Western blot法检测相关蛋白的表达。抑制剂Eritoran特异性阻断TLR4/MyD88/NF-κB通路,检测TLR4/MyD88/NF-κB通路阻断后对细胞周期、细胞增殖、细胞迁移及TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达的影响。结果 IL-18可促进支气管平滑肌细胞细胞增殖,提高细胞迁移能力,上调TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平(P<0.05)。Eritoran可抑制IL-18引起的BSMC细胞增殖,上调G1期细胞百分比,下调S期、G2期细胞百分比,抑制细胞迁移,降低TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平(P<0.05)。结论 IL-18可能通过上调TLR4/MyD88/NF-κB通路中信号分子的表达,促进了平滑肌细胞增殖和迁移。

siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响

目的探讨siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响。方法将20只雌性BALB/c小鼠分为实验组和对照组,实验组构建哮喘模型,取气管和支气管进行细胞培养。对实验组和对照组培养的气道壁平滑肌细胞分别进行分组：磷酸盐缓冲液（PBS）对照组（加入PBS）、错义链对照组（转染错义链）和siRNA转染组（转染siRNA Survivin）,检测气道壁平滑肌细胞中Survivin基因、Survivin蛋白和caspase-9蛋白表达,检测细胞上清液中IL-6和人趋化因子（CCL5）水平。结果 RT-PCR结果显示,实验组中siRNA转染组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均低于PBS对照组和错义链对照组,气道壁平滑肌细胞中Survivin蛋白表达量均低于PBS对照组和错义链对照组,而caspase-9蛋白表达量则高于PBS对照组和错义链对照组,差异均有统计学意义（P〈0.05）;实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS对照组和错义链对照组;2~4d细胞增殖量均低于PBS对照组和错义链对照组;气道壁平滑肌细胞G0/G1期比例高于PBS对照组和错义链对照组,而S/G2期比例则低于PBS对照组和错义链对照组,细胞凋亡率则高于PBS对照组和错义链对照组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 siRNA特异性沉默Survivin基因,可加速气道壁平滑肌细胞凋亡,有效抑制细胞异常增殖及分泌功能。