mTOR信号通路影响人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性

生物电信号指导的细胞定向迁移行为在多细胞生物体的重大生理和病理过程中发挥重要作用,然而电信号指导细胞定向迁移的机制并不清楚.利用体外直流电刺激探究细胞定向迁移机制是研究生物电信号指导细胞行为常用的手段.作者对人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性作用进行了研究,发现在300 mV/mm的直流电场中,HL60细胞发生明显朝向电场阴极的趋电性运动,其趋电性指数和轨迹速度分别为0.89±0.04和9.72±0.38μm/min;Rictor敲低突变株的趋电性与野生型之间无限制性差异.利用高浓度mTOR的特异性抑制剂PP242药物处理HL60细胞后,细胞在直流电场中的趋电性指数降低到0.82±0.06,运动速度也被显著抑制.以上研究结果表明,mTOR信号通路在HL60细胞的趋电性运动中发挥了一定的作用,但Rictor并不是关键基因.研究结果为开发生物电场依赖的靶向药物提供了理论基础.

异叶败酱中三萜化合物常春藤皂苷元对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、周期阻滞及凋亡诱导作用

利用倒置显微镜观察法、台盼蓝排染法、Hoechst33258荧光染色法、DNAladder电泳以及流式细胞分析技术,检测了从甘肃产异叶败酱(Patrinia heterophyllaBunge.)中分离得到的三萜化合物常春藤皂苷元(HG)对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、周期阻滞及凋亡诱导作用.结果表明,常春藤皂苷元在较低浓度(10～40μmol·L-1)条件下,对HL-60细胞增殖具有良好的抑制作用;在较高浓度(40～50μmol·L-1)条件下,对HL-60细胞具有致死作用;同时,常春藤皂苷元对HL-60细胞的G1期阻滞和凋亡诱导作用极可能是其实现增殖抑制和致死作用的主要途径.

虎刺醛对人早幼粒白血病细胞HL-60的生长抑制、周期阻滞、凋亡诱导及DNA损伤作用

利用生长曲线法、流式细胞术、AO/EB双染法及单细胞凝胶电泳法,分别检测了蒽醌化合物虎刺醛对人早幼粒白血病细胞HL-60的生长抑制、细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导以及DNA损伤能力.结果表明,2.5～12.5μg.mL-1的虎刺醛对人早幼粒白血病细胞HL-60具有显著的生长抑制作用;不同浓度(5～40μg.mL-1)的虎刺醛,可引起HL-60细胞G1期、S期和G2/M期周期阻滞;在2.5～12.5μg.mL-1浓度范围和24～48h培养时间下,虎刺醛可不同程度诱导HL-60细胞,其凋亡率达到显著水平(P<0.05)或极显著水平(P<0.01),且具有时间和浓度依赖性关系;与对照组相比,药物处理组(5～12.5μg.mL-1)均有极显著性(P<0.01)的彗星率,这表明,该浓度条件下,虎刺醛可较大程度地导致细胞核DNA损伤,这可能是引起周期阻滞进而抑制细胞增殖,最终导致细胞凋亡的原因.

对映-贝壳杉烷二萜Leukamenin E对人早幼粒白血病细胞HL-60生长抑制及凋亡诱导的影响

利用台盼蓝排染法检测Leukamenin E对HL-60细胞生长的抑制作用；在倒置显微镜及荧光显微镜下分别检测细胞和细胞核形态变化；进一步采用流式细胞术和AO/EB荧光双染法检测Leukamenin E对 HL-60细胞周期分布的影响及诱导细胞凋亡的作用．结果表明，化合物Leukamenin E对HL-60细胞生长有很强的抑制作用，在低浓度和短时间条件下抑制 HL-60细胞的生长，高浓度（2.1～2.7μmol·L -1）及长时间（＞36 h）条件下对细胞具有致死作用，呈时间-剂量依赖性；1.5～2.7μmol·L -1 Leukamenin E处理24 h和48 h均引起了HL-60细胞显著的S期阻滞，同时产生显著的细胞凋亡（P＜0.01），且存在时间-剂量效应；与对照组相比， Leukamenin E处理组产生肾形核，并伴随有多核的产生．

三氧化二砷联合Trolox对人早幼粒白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响

利用MTT法、台盼蓝排染法、Hoechst33258荧光染色法、瑞氏-姬姆萨染色法以及单细胞凝胶电泳法检测了三氧化二砷(As2O3)单独作用及联合Trolox后对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、凋亡诱导作用及其DNA损伤作用.结果表明,1μmol.L-1As2O3作用即可抑制HL-60细胞的增殖,联合100μmol.L-1Trolox对HL-60细胞增殖抑制作用较As2O3单独作用时明显增强.高浓度的As2O3(4μmol.L-1)作用24h可引起HL-60细胞的凋亡,与Trolox联合作用,在低浓度(1μmol.L-1)下即可引起细胞凋亡.联合100μmol.L-1Trolox可以显著增强As2O3引起的HL-60细胞的DNA损伤.这种损伤可能导致细胞周期阻滞,从而在生长曲线中体现出对HL-60细胞的增殖抑制作用.

人早幼粒白血病细胞裸鼠异种移植模型的傅里叶变换红外光谱探索

应用傅里叶变换红外光谱法对HL-60(人早幼粒白血病细胞)裸鼠异种移植模型癌变及癌旁正常组织粉末样品进行了分析研究.结果表明:(1)甲基CH3和蛋白质分子C-O峰在癌变组织中均有不同程度的频移,(2)正常组织的红外光谱在1746 cm-1处存在较强的吸收峰,而在肿瘤中只有较弱的吸收峰或观察不到吸收峰,(3)癌变组织核酸分子磷酸二脂基团PO2-的对称伸缩振动的相对吸收强度明显增强,(4)正常组织中脂类分子弯曲振动谱带吸收峰相对强度明显强于甲基变角振动谱带的相对强度,而在癌变组织中这两处吸收峰的相对强度大小基本相等.说明傅里叶变换红外光谱法可以用于对裸鼠癌变组织进行鉴别诊断,利用动物异种移植模型进行红外光谱分析可成为肿瘤红外光谱研究的一种新方法.

人早幼粒白血病细胞移植瘤株的建立及其实验治疗

将人早幼粒白血病细胞(HL-60)移植裸鼠皮下,形成了实体型移植瘤(HL-60X)。瘤株已传7代,成瘤率达100％。用该移植瘤模型初步观察到,多胺生物合成抑制剂二氟甲基乌氨酸(DFMO)、阿霉素、及两种药物联合使用,对肿瘤生长有抑制作用。抑制率分别为:55％、65％、99.4％。DFMO组对动物体重略有影响,阿霉素组则不明显。瘤组织病理检查表明,除程度不同的瘤细胞坏死外,对HL-60具有诱导分化作用。用药后肿瘤组织再次接种裸鼠,未见成瘤。实验结果说明,DFMO有增强阿霉素的抗癌作用。

人早幼粒白血病细胞与小鼠网织红细胞融合的胞质杂交细胞形态学观察

本研究对HGPRT缺失的人早幼粒白血病细胞突变株(HL-60-AR)与小鼠网织红细胞融合所形成的胞质杂交细胞,进行了光镜和电镜的形态学观察。所得结果显示:胞质杂交细胞在短期培养过程中,可见大量细胞呈现核固缩和核偏位,甚至出现排核现象;长期培养的胞质杂交细胞沿不同途径向较成熟的方向分化。本文并讨论了网织红细胞胞质因子对人早幼粒白血病细胞分化途径的影响。

对映-贝壳杉烷型二萜化合物Wangzaozin A对人早幼粒白血病HL-60细胞生长抑制和凋亡诱导的作用

目的研究对映-贝壳杉烷型二萜Wangzaozin A对人早幼粒白血病细胞HL-60生长抑制、周期阻滞、凋亡诱导作用以及相关的机制。方法利用倒置显微镜观察和台盼蓝排染法检测了Wangzaozin A对HL-60细胞生长的影响;采用流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染法检测化合物对细胞周期分布的影响以及诱导HL-60细胞凋亡的能力;进一步利用单细胞凝胶电泳法测试化合物对细胞DNA的损伤。结果 1～4μmol/L的Wangzaozin A对HL-60细胞具有较强的生长抑制作用,较高浓度(3μmol/L和4μmol/L)和较长处理时间(48～72 h)有较强的致死效应;1～2.5μmol/L药物处理细胞24 h或48 h条件下细胞周期分布主要表现为G1期阻滞;4μmol/L药物处理12～60 h条件下细胞周期分布主要表现为很强的S期阻滞;2～4μmol/L药物作用24 h或48 h可诱导凋亡产生,其凋亡率呈显著水平(P<0.01),相同条件下,药物对细胞DNA的损伤与对照相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论该化合物对HL-60细胞DNA的损伤作用极可能是引起细胞生长抑制、周期阻滞及凋亡的直接原因。

贵州产天冬总皂苷提取物对人早幼粒白血病细胞株HL-60的影响

目的:提取贵州产天冬中总皂苷(ASP)并研究其对人早幼粒白血病细胞株HL-60增殖和凋亡作用。方法:选取贵州产天冬为研究对象,提取其总皂苷成分;以不同浓度梯度的天冬总皂苷提取物作用于人早幼粒白血病细胞株HL-60,采用MTT法检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡率;应用实时定量(Real-time)PCR检测各组HL-60细胞中B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)mRNA的表达。结果:随着天冬总皂苷浓度的升高,其对HL-60细胞增殖的抑制作用明显增强,呈现剂量依赖趋势;与对照组相比,天冬总皂苷组使HL-60细胞凋亡率明显增加;并且能够使HL-60细胞内的Bcl-2 mRNA表达下降。结论:贵州产天冬总皂苷提取物下调Bcl-2 mRNA的表达、诱导人早幼粒白血病细胞株HL-60凋亡,可能是其治疗白血病的机制之一。

长期培养人急性髓系白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞的影响

目的:通过观察长期培养的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞体外的作用,寻求一种体外净化辅助方法。方法:实验于2002-04/2003-12在大连医科大学附属第二医院血液内科实验室完成。20例急性髓细胞白血病为初诊或复发病例。男11例,女9例,19～55岁,平均36.8岁,由大连医科大学附属第二医院血液内科、大连市友谊医院血液内科、铁路医院血液科、大连大学附属医院血液科提供。患者知情同意并签署知情同意书。诊断均符合张之南主编的“血液病诊断及疗效标准”,其中M12例,M28例,M34例,M42例,M54例。常规分离培养人骨髓基质细胞,收集14,28,35d的上清分别与早幼粒白血病细胞共孵育,以不加入急性髓细胞白血病基质上清液的早幼粒白血病细胞的培养体系作为阴性对照,通过形态、流式细胞术、DNA电泳来观察早幼粒白血病细胞有无分化及凋亡表现。结果:20例患者均进入结果分析。①急性髓细胞白血病骨髓基质细胞是由网状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞组成。②Wright-Giemsa染色可见阴性对照早幼粒白血病细胞为悬浮生长,胞体内含颗粒,增殖旺盛,镜下常见核分裂、增殖状态的早幼粒白血病细胞;14d及28d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞,形态未见明显变化,35d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞出现细胞变形,细胞核出现改变,部分细胞核仁减少或消失。NBT还原实验发现部分早幼粒白血病细胞胞奖内出现紫蓝色颗粒,并见到核碎解成染色质小体(凋亡小体)。③35d时相上清液孵育的早幼粒白血病细胞部分出现分化现象,部分出现凋亡小体,DNA电泳见梯形带,流式细胞术检测出凋亡峰。④培养35d的急性髓细胞白血病基质上清液对早幼粒白血病细胞的诱导分化及促凋亡作用明显强于培养14,28d的急性髓细胞白血病基质上清液及阴性对照组[分化细胞数:1.5±1.8,2.1±1.5,17.3±3.0,41.0±11.1;凋亡细胞数:5.2±1.7,7.3±1.9,10.1±2.2,35.2±13.9,P<0.05],其他组间差异不显著。结论:培养35d的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞具有诱导分化、促进凋亡的作用。可能为白血病体外净化提供一种辅助方法。

裸鼠人早幼粒白血病突变株细胞(HL-60-AR)异种移植模型的建立

将HGPRT~-的人早幼粒白血病突变株细胞(HL-60-AR)接种于裸鼠皮下,能形成实体性白血病肉瘤。肿瘤组织经光镜形态学、细胞超微结构、细胞化学、LDH同工酶谱、染色体分析、细胞遗传标记、以及分化性状的检测等多项指标鉴定,均类似于原来体外长期培养的细胞株。移植瘤细胞能在裸鼠体内连续传代,迄今已传至第12代。这个裸鼠人白血病细胞异种移植模型的建立,将为研究人类白血病细胞在体内的增殖、分化以及对抗白血病药物治疗的反应,提供一个有价值的实验系统。

苞叶香茶菜庚素诱导人白血病细胞系HL-60凋亡的分子机制研究

目的:观察苞叶香茶菜庚素(melissoidesin G,MOG)对多种肿瘤细胞系的细胞毒活性,并研究MOG诱导白血病细胞系HL-60凋亡的相关分子机制。方法:用MTT法评价化合物对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性;通过流式细胞术PI单染法观察化合物对肿瘤细胞内DNA含量的影响,以分析周期变化;Annexin V染色法分析凋亡;荧光底物发光法检测caspase活性;膜电位依赖性结合的荧光探针JC-1标记法检测线粒体膜电位(△Ψm);Western blotting检测蛋白表达。结果:(1)MOG对多种肿瘤细胞系均有一定的增殖抑制作用;(2)MOG诱导HL-60细胞发生剂量依赖性凋亡;(3)在MOG作用下,HL-60细胞出现时间依赖性的△Ψm降低;(4)HL-60细胞在MOG作用6～12h后caspase-3和caspase-7均被明显激活,且在抑制剂Z-VAD-FMK的作用下,MOG诱导的caspase激活和细胞凋亡被完全抑制;(5)抗氧化剂NAC可以抑制MOG诱导的△Ψm降低、细胞凋亡及caspase-3激活。结论:MOG能够明显抑制肿瘤细胞增殖,并通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用。推测MOG可能通过引起细胞内氧化还原状态失平衡,进一步破坏线粒体功能,并激活caspase通路引起肿瘤细胞凋亡。

2-α-羟基熊果酸对人白血病细胞HL-60的周期阻滞及凋亡作用

利用台盼蓝法、吖啶橙/溴乙锭双染检测法和流式细胞术检测了2α-羟基熊果酸对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果表明,在低浓度（15-30μmol.l-1）时药物抑制HL-60细胞的生长,高浓度（30,35μmol.l-1）对细胞有致死效应,且呈现剂量依赖和时间依赖性;双染分析表明,药物能够诱导细胞凋亡,随着药物浓度增加和处理时间的延长,细胞凋亡率上升,并且伴有少量细胞坏死;进一步用流式细胞术检测,发现在20μmol.l-1时,2α-羟基熊果酸引起明显的G1期阻滞,随着药物浓度升高,周期阻滞作用明显加强。因此,细胞周期阻滞可能是药物抑制细胞增殖进而引起凋亡的原因。

广东省凤尾蕨属植物抗白血病药物研究

目的探讨广东地区5种常见凤尾蕨属植物半边旗、剑叶凤尾蕨、刺齿凤尾蕨、蜈蚣草和井栏边草对白血病细胞生长的抑制作用。方法用乙醇经索氏提取器分别提取5种植物的有效成分,以二甲基亚砜分别配制供试品溶液;将供试品溶液加入对数生长期的人早幼粒白血病HL-60细胞株(简称HL-60细胞)和人慢性髓样白血病K562细胞株(简称K562细胞)中,采用台盼蓝染色法染色,统计细胞存活率。结果半边旗、剑叶凤尾蕨、刺齿凤尾蕨、蜈蚣草和井栏边草对HL-60细胞和K562细胞的生长均有抑制作用,其中半边旗和刺齿凤尾蕨对HL-60细胞生长的抑制作用较强,4.0 g/L半边旗和刺齿凤尾蕨乙醇提取物中,HL-60细胞的存活率均为0;半边旗和蜈蚣草对K562细胞生长的抑制作用较强,4.0 g/L半边旗和蜈蚣草乙醇提取物中,K562细胞的存活率分别为0和7.70%。结论 5种凤尾蕨属植物对HL-60细胞的生长抑制作用强于K562细胞;除半边旗外,刺齿凤尾蕨和蜈蚣草可能是潜在的抗白血病药物。

低强度微波对γ射线致人早幼粒白血病HL-60细胞损伤的影响

[目的]探讨低强度微波辐射对γ射线致人早幼粒白血病HL-60细胞的凋亡率、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和胞内游离Ca2+浓度改变的影响。[方法]将人早幼粒白血病HL-60细胞随机分为对照组、单纯微波组、单纯γ射线组和联合组(微波+γ射线)。单纯微波组和联合组给予12μW/cm2微波照射,每天1 h,连续辐照3 d;第4天给予单纯γ射线组和联合组8 Gyγ射线照射。用钙离子依赖性磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双标记法检测细胞凋亡率,流式细胞仪检测线粒体膜电位和胞内游离Ca2+浓度。[结果]与对照组相比,单纯γ射线组凋亡率明显增加(P<0.05);联合组凋亡率与单纯γ射线组相比显著降低(P<0.05)。与对照组相比,单纯γ射线组线粒体膜电位下降明显(P<0.05);联合组线粒体膜电位与单纯γ射线组相比显著升高(P<0.05)。与对照组相比,单纯γ射线组胞内游离Ca2+浓度明显升高(P<0.05);与单纯γ射线组相比,联合组胞内游离Ca2+浓度明显降低(P<0.05)。[结论]本实验条件下,8 Gyγ射线可以引起细胞凋亡率增加、线粒体膜电位下降和胞内游离Ca2+浓度增高,导致细胞损伤。预先900 MHz、12μW/cm2低强度微波照射能够显著减轻γ射线引起的细胞损伤,表现为细胞凋亡率减少、线粒体膜电位升高和细胞内游离Ca2+浓度降低。

长期传代后HL-60细胞内脱氧胞苷激酶与阿糖胞苷耐药性的关系

目的通过观察人早幼粒白血病细胞系(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R)经过长期传代后细胞内脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,dck)mRNA表达及其酶活性的变化规律,探讨dck与阿糖胞苷(Ara-C)疗效及耐药现象发生的相关性。方法分别采用实时PCR方法和核素液闪法测定HL-60和HL-60/R细胞内dck的mRNA表达水平及其酶活性水平。通过体外培养传代,观察2种细胞株经长期传代(5、10、20、30、40、50代)后细胞内dck的mRNA表达及酶活性的变化规律。结果传代初期结果显示,HL-60和HL-60/R两组细胞株之间的mRNA表达水平分别为0.37±0.03和0.17±0.03,活性值分别为0.069±0.006nmol.min-1.mg-1 protein和0.019±0.007nmol.min-1.mg-1 protein,HL-60的dck mRNA表达水平和酶活性均明显高于HL-60/R(P<0.01)。并且两组细胞株之间的显著性差异(P<0.01)持续存在于各传代过程中。HL-60和HL-60/R两组各传代节点(10、20、30、40和50代)的dck mRNA表达水平与酶活性与本组第5代细胞相比,则无明显变化(P>0.05)。结论 HL-60及HL-60/R两组细胞株间的dck mRNA表达和酶活性在传代初期存在显著差异,且两组间的差异持续存在。但与各自的初期传代相比,长期传代后的dck mRNA表达和酶活性变化并不明显,提示dck仅与Ara-C的初期疗效明显相关,而与Ara-C耐药现象的发生可能无关。

长期传代后HL-60细胞内5'-核苷酸酶-Ⅱ基因表达与阿糖胞苷耐药性的关系

目的观察白血病细胞株(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R)胞浆5'-核苷酸酶-Ⅱ(CN-Ⅱ)基因表达,以及长期传代后的变化规律,探索CN-Ⅱ与Ara-C疗效及耐药机制的相关性。方法采用RT-PCR方法测定HL-60和HL-60/R的细胞内CN-ⅡmRNA表达,并通过体外培养传代,检测长期传代(5、10、20、30、40、50代)后CN-ⅡmRNA表达变化。结果培养初期结果显示,HL-60和HL-60/R的CN-ⅡmRNA表达水平分别为0.23±0.04和0.47±0.05,HL-60/R的CN-ⅡmRNA表达水平明显高于HL-60(P<0.05)。经长期培养传代至10、20、30、40和50代,各传代检测节点的HL-60和HL-60/R细胞内CN-ⅡmRNA表达水平均无明显变化(P均>0.05)。上述各传代检测节点,HL-60/R的CN-ⅡmRNA表达水平均明显高于HL-60(P均<0.05)。结论 HL-60、HL-60/R细胞中CN-ⅡmRNA表达差异有统计学意义。经长期传代后,上述差异持续存在,提示CN-Ⅱ表达与Ara-C的疗效相关,但在长期传代后,变化并不明显,可能与Ara-C耐药现象的发生无关。

HL-60细胞内阿糖胞苷活性成分动态观察

目的探索与研究建立白血病细胞内阿糖胞苷(Ara-C)活性成分及其代谢产物阿糖尿苷(Ara-U)水平测定方法,并观察白血病细胞内上述Ara-C活性相关物质的变化规律与差异。方法采用白血病细胞株(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R),在Ara-C作用下长期传代。对5、10、20、30、40、50代细胞,分别采用放射免疫法(RIA)和高效液相色谱法(HPLC)动态观察和比较两种细胞内的Ara-C活性成分,即三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)、与DNA嵌合的Ara-C以及Ara-U的水平。结果 HL-60细胞内Ara-CTP、与DNA嵌合的Ara-C在传至20代后,均呈现持续下降;在细胞传代初期至第40代,各阶段HL-60细胞内Ara-CTP水平均显著高于HL-60/R;在传代初期至第20代过程中,HL-60和HL-60/R细胞内的与DNA嵌合的Ara-C并无显著差异。经长期传代之后,HL-60细胞内的Ara-U呈持续上升,且均显著高于相同传代阶段的HL-60/R。结论白血病细胞在Ara-C的长期作用下,Ara-CTP、与DNA嵌合的Ara-C水平,在不同时段出现明显下降趋势,可能是导致白血病患者发生对Ara-C耐药的主要原因。