人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位预测及进化分析

目的预测人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位,并分析其进化特征。方法从GISAID和Gen Bank两大数据库获得人易感H6N1病毒的血凝素蛋白及近缘序列,采用多款预测软件分别预测了其B细胞线性和构象型抗原表位,并分析了这些表位的保守性、适应性和进化特征。结果综合各种因素共预测出4个线性表位(表位A、B、C和D)和2个构象型表位(表位E和F)。表位C和位点41、157、186、187在进化过程中易发生突变,其余表位较为保守,其中表位D最保守;位点157受到强烈的正选择作用,它可能是H6N1病毒逃避宿主免疫系统攻击的一个关键位点。结论人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白拥有5个保守的B细胞抗原表位(3个线性、2个构象型)和1个正选择作用位点,将为其疫苗的研制、致病机制的理解和病毒防治提供理论基础。

2019-2022年中国H6N1亚型禽流感病毒的生物学特性分析

【背景】H6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)广泛流行于我国南方地区,是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配,并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段,产生新型重组病毒,进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究,为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省(直辖市、自治区)的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子,通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序,分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明,7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高,基因来源复杂,具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明,H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播,欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源,根据贝叶斯演化分析结果,推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成,后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示,病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF,符合低致病性AIV特征;此外,另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变,据报道,该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明,部分毒株具有双受体结合特性,但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明,鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒,并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒,病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明,H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制,但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒,候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国;部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制,表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

鸭源性H6N1亚型禽流感病毒在猪和人呼吸道的复制及其基因特点

目的:探索鸭源性H6N1亚型禽流感病毒是否可在人以及流感病毒的重要中间宿主猪中有效复制、感染。方法:选择前期分离的2株鸭源性H6N1病毒DK/Jiangxi/35634/2016、DK/Guiyang/2462/2007,受体结合特异性法分析病毒的受体结合特性,全基因组测序分析病毒基因位点的变化,体外感染人和猪呼吸道组织。结果:2株鸭源性H6N1病毒均与禽型SAα-2,3Gal受体结合,基因测序分析显示HA裂解位点为PQIETR/GL,属低致病性禽流感病毒的分子特征,HA、NA、PB2等主要基因位点未发生突变,但病毒可在人肺组织的肺泡细胞和巨噬细胞、猪气管上皮细胞以及肺组织的肺泡细胞和巨噬细胞增殖并引起细胞损伤、组织结构的破坏。结论:鸭源性H6N1亚型禽流感病毒具有禽流感病毒的基因特点,虽然仍与禽型SAα-2,3Gal受体结合,但已具有跨种间屏障感染猪和人的能力。因此,必须密切监测家禽中流感病毒H6N1流行和进化演变。

一株鸡源H6N1亚型禽流感病毒全基因的分子特征

2008年国家禽流感参考实验室在我国禽流感流行病学调查期间分离到1株鸡源H6N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/ZheJiang/80/2008(H6N1)(简称为CK/ZJ/80/08),为了弄清该病毒的分子特征,我们对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,对每个基因进行BLAST分析,找出同源性最高的毒株。利用DNAStar中的Megalign功能进行进化分析。结果表明CK/ZJ/80/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为QIETR↓GLF,推测可能为一株低致病力AIV。其HA基因与日本北海道的A/duck/Hokkaido/228/2003(H6N8)和黑龙江的A/mallard/Heilongjiang/131/2006(H6N2)以及香港早期分离株A/chicken/HongKong/17/77(H6N1)等处于同一分支;NA基因在颈部没有缺失,与A/duck/Tsukuba/718/2005(H1N1)、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)等处于同一分支;M基因与A/duck/Hokkaido/W90/2007(H10N7)高度同源(同源性为99%);NS基因与A/duck/Denmark/65047/04(H5N2)和A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)处于同一分支。NP、PA、PB1、PB2分别与贵州和江西分离的H5N2亚型AIV的相应基因关系密切,同源性分别为98%、97%、97%、97%。由此推测CK/ZJ/80/08可能是由H6N2、H1N1、H10N7、H5N2等多个亚型病毒重组而成。

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒(AIV)在广西中越边境地区的流行情况,本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6),对其HA和NA基因进行序列测定,并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示,分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)的核苷酸同源性最高(96.9%),NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)的核苷酸同源性最高(98.2%)。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征;与部分N6亚型禽流感病毒一样,分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外,本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定,结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2,3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6)是一株重组低致病性禽流感病毒。

A/H6N1亚型禽流感病毒致病性评估及与2009 A/H1N1亚型流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性

目的探讨人、禽流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性,为下一步研究H6亚型禽流感病毒重配和致病性变异的分子机制奠定基础。方法野鸭源A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007以101EID50～106EID50的攻毒剂量经鼻内途径感染小鼠,通过临床症状观察、病毒滴定和病理切片观察进行病毒学和组织学两方面检测对小鼠的致病性;同时,将此病毒与2009年A/H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)混合感染豚鼠,分析两株病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性。每天采集豚鼠鼻洗液并用噬斑纯化技术获得重配病毒,对获得的重配病毒进行全基因组序列的测定。结果 H6N1亚型禽流感病毒能直接感染小鼠,但对小鼠不致死。106EID50的攻毒剂量可有效感染小鼠,攻毒后第5天,小鼠表现出被毛较粗乱、活动减少、体重下降、呼吸急促的临床症状,但至攻毒后第10天开始康复,而对照组(MOCK)小鼠在14 d的观察期内无明显临床症状。病毒滴定结果表明,该病毒主要在小鼠肺脏和鼻甲骨中复制,病毒滴度可达104.5EID50/mL。病理学观察发现感染小鼠肺泡壁增厚,有大量炎性细胞浸润,纤维蛋白渗出并伴有轻微出血;在A/H6N1和A/H1N1混合感染豚鼠的重配实验中,经过三轮噬斑纯化从豚鼠鼻洗液中分离到6株重配病毒,说明A/H6N1亚型禽流感病毒与A/H1N1亚型流感病毒具有很好的遗传兼容性,能在豚鼠体内能发生重配。结论野鸭源A/H6N1亚型流感病毒无需适应就能够感染哺乳动物;该病毒与A/H1N1流感病毒具有很好的遗传兼容性,在哺乳动物体内能够发生基因重配,产生新的重配病毒,其公共卫生意义应引起高度关注。

H5N1禽流感病毒对C57BL／6小鼠的致病性研究

本试验利用虎源H5N1禽流感病毒对6～8周龄雌性C57BL/6小鼠进行滴鼻感染,观测小鼠临床症状和组织病理变化,于感染后第3d和第5d每组分别处死3只小鼠,测定肺、脑、脾、肾、肝组织中的病毒含量;并测定该病毒对C57BL/6小鼠的MLD50。结果表明感染小鼠出现精神不振、体重下降、支气管炎和间质性肺炎为主的临床症状和病理变化;测得感染后小鼠肺脏中病毒拷贝数和病毒滴度最高,其次是脑、肾、脾、肝等组织;该病毒对C57BL/6小鼠的MLD50为10-6.5/0.05mL。此研究成功进行了H5N1禽流感病毒对C57BL/6小鼠的感染,可以作为感染模型进行H5N1禽流感病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。

人感染H6N1禽流感病毒HA基因的分子特征及进化分析

目的检测人感染H6N1禽流感病毒HA基因的分子特征、致病机制、来源及进化。方法从Flu和GISAID两大数据库中获得人感染H6N1及近缘禽流感病毒的HA序列,通过ML、MP、BI法构建系统发育树,推测进化速率和最近共同祖先(TMRCA)时间,并分析相关变异位点、糖基化位点及裂解位点。结果人感染与台湾3株禽感染H6N1病毒聚成一支,最近共同祖先时间为2002年,目前正在流行,且进化速度很快。其氨基酸序列含有5个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点,裂解位点上游仅1个碱性氨基酸,拥有两个特异的变异位点P186L和A287T。结论人感染H6N1禽流感病毒目前仍是一种低致病性禽流感病毒,其HA基因由家鸡的序列进化而来。由于其高的进化速率及病毒重配的可能性,应引起高度重视。

一株野鸟源重组禽流感(H6N1)病毒基因组分子特征分析

2017年在江苏省野生豆雁粪便中分离得到1株H6N1亚型禽流感病毒A/Anser fabalis/Jiangsu/J746/2017(H6N1)(J746)。本研究对J746进行了全基因组测序,并对其进行了遗传进化分析。遗传进化分析结果表明:与HA和NA基因同源性最高的毒株为A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1),同源性为99.4%。HA基因与流行于韩国、日本和孟加拉的N1、N2、N8亚型毒株处于同一分支,NA基因与韩国野生水禽的H6、H7亚型毒株处于同一分支,PB2基因与中亚及东亚地区低致性病毒株处于同一分支,PB1基因和NP基因与流行在东南亚的低致病性毒株处于同一分支,PA基因和M基因均处于欧亚分支,但PA形成了独立的小分支,NS基因与分离于中国中南部和日本的毒株聚集在一起。氨基酸位点分析表明,神经氨酸(NA)蛋白存在H274Y突变,该突变可增强病毒对神经氨酸酶抑制剂药物的耐药性;同时在PB2蛋白中发现与增强对小鼠致病性有关的L89V突变,在NS1蛋白中发现与增强对小鼠致病性、提高复制能力和改变宿主嗜性有关的P42S、L103F、I106M、N205S突变。综上所述,J746毒株基因组构成来源复杂,是由多个国家和地区形成的一株多元重组病毒。

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。

湖北省部分地区规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫效果调查

禽流感（avian infl uenza,AI）是由A型流感病毒（Avian infl uenza virus,AIV）感染禽类引起的一种从呼吸系统到全身严重败血症等多种症状的高度接触性传染病。目前,对我国家禽产业危害最大的高致病性禽流感病毒是H5禽流感病毒,几乎所有的规模化蛋鸡场都进行了H5禽流感疫苗的预防接种。为了解湖北省规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型疫苗免疫后抗体滴度,本研究于2014年1～12月期间在湖北省13个地区选择不同规模化蛋鸡场,随机采集2079份蛋鸡血样,用血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）实验检测了H5N1 Re-6亚型禽流感抗体,并对测定结果进行了统计与分析。结果显示,规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型抗体滴度在6 log2以上的样品数占89.2%,能够保护鸡群抵抗同型病毒的感染。但H5N1 Re-6亚型禽流感抗体滴度整体不高,且仍有少量地区H5N1 Re-6亚型禽流感免疫合格率为60%～80%,提示部分鸡群一旦感染该型病毒,仍然存在发病的危险。

不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒H5N1感染的敏感性及其机制探讨

目的比较不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒的易感性,并探讨可能的原因。方法四种免疫状态的小鼠,无菌BALB/c小鼠,SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,以10 TCID50的禽流感病毒50μL感染小鼠,观察小鼠的体重变化,存活率,各组织脏器的病毒分布,肺组织的细胞因子变化和肺组织病理病变。结果四种小鼠均能感染禽流感病毒,其中,无菌小鼠对禽流感病毒H5N1的易感性最低,存活率最高。并且病毒在无菌鼠体内病毒的复制水平最低,细胞因子TNF-α,IL-12,MIP2,GATA3,IFN-a/β在感染后表达水平最低,其中第7天最低。结论无菌小鼠能感染禽流感病毒,但是相比较SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,其易感性最低,可能与病毒在组织内的低复制和细胞因子的低表达均有关。

微生物所等揭示H6N1亚型禽流感病毒跨物种传播机制

2013年6月,在台湾发现了全球首例人类感染H6N1亚型禽流感病例。从患者体内所分离的病毒基因序列显示,此病毒为一典型的低致病性禽流感病毒,与台湾本土家禽中的H6N1病毒株非常接近,其跨物种传播的分子机制成为世界科学家所关注的焦点,中国科学院微生物研究所研究员、中科院院士高福课题组在此方面的研究取得新进展,相关研究成果已于5月4日在线发表在国际杂志The EMBO Journal上。

规模化旱养肉鸭禽流感疫苗H5N1(Re-6)株免疫程序的研究与推广

高致病性禽流感是由正黏病毒科、流感病毒属A型H5或H7等亚型流感病毒引起的,以禽类为主的高度接触性传染病,近年来在全球范围内已呈多发态势,造成了相当大的经济损失和政治影响,并直接威胁到人类生命及公共卫生安全。

亚洲H5N1型禽流感暴发的回顾与反思

亚洲暴发的H5N1型禽流感疫情带给我们很多教训和启示。对发生疫情的国家来说,疫苗接种是一种行之有效的防控措施,但单纯使用疫苗却无法将H5N1从一个国家根除,但是疫苗接种能够显著地降低家禽对病毒的易感性并能减缓病毒扩散的速度。同时,在疫区采取大规模扑杀的措施也能降低当地家禽发生病毒感染的程度。然而,对于有疫情发生的国家来说,当疫情得到控制之后,在疫区恢复饲养的家禽对H5N1病毒易感性较高,致使该地区很可能再次暴发新的疫情。因此,在H5N1禽流感的防控工作中除了做到扑杀和疫苗接种之外,还必须同时辅助采取其它措施以达到预期的防控效果。由于家鸭和大规模的活禽市场中的家禽可以感染禽流感病毒而不易被察觉,因此它们成为特定地区持续发生H5N1感染的重要原因。在与H5N1病毒的斗争中,各个国家都必须广泛交流并制定出符合各自国情的最佳防控措施。对于疫情监测数据,包括感染和发病信息在内都必须共享。各项防控措施在实施之前必须通过社会经济学和生态学评估,这一点对于贫穷的农村地区尤为重要。

泰国人流感H5N1病毒全基因组特征

2001年，将H5N1禽流感病毒分为A～E5种基因型。2002年后，未再发现这些基因型，而出现了8种新的基因型（V、W、X1、X2、X3、Y、Z和Z^＋）。2003年末到2004年5月，H5N1流感A病毒的再现首次波及大部分东南亚国家，然而，仅越南和泰国报告了人类病例。人们一般认为2003～2004在东亚和东南亚H5N1病毒有共同的起源，且已发现它们在抗原性上应有别于1997年和2003年初的病毒，

甲型H1N1流感易感者

根据卫生部2009年10月12日发布的《甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）》，甲型H1N1流感人群普遍易感；但是，下列人群出现流感样症状后，较易发展为重症病例，应当给予高度重视，尽早进行甲型HINI流感病毒核酸检测及其他必要检查：①妊娠期妇女；②伴有以下疾病或状况者：慢性呼吸系统疾病、心血管系统疾病（高血压除外）、肾病、肝病、血液系统疾病、神经系统及神经肌肉疾病、

番鸭对高致病性禽流感病毒的易感性高于北京鸭

H5N1亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV）持续威胁全世界的家禽养殖，家鸭被认为是传播该病原的主要对象。美国农业部农业研究服务署的科学家检测了H5N1HPAIV对不同家鸭的致病性以及不同感染途径对感染结果的影响。结果显示，与北京鸭、绿头鸭、黑色跑鸭、鲁昂鸭、咔叽一康贝尔鸭这些家鸭品种相比，番鸭感染后患病程度更为严重。对北京鸭和番鸭采用滴鼻、泄殖腔接种、滴眼3种方法接种不同毒力的病毒后，无论采用何种途径，它们的感染程度都相似，但与病毒毒力相关。由此可见，家鸭通过上述3种途径接触H5N1HPAIV都易感，但患病程度随病毒毒力和品种有所不同。

全面防控H7N9禽流感

H7N9禽流感病毒是甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）,其引发的急性传染病2013年先后在上海、江苏、浙江、安徽、江西等地发现,之后目前全国有22个省市出现了传染病例,该病有逐渐从南向北蔓延的趋势,疫情形势不容乐观。该病毒基因变异后能够感染人类,人的易感群体大多为12岁以下的儿童、60岁以上免疫力较低的老年人群,传染途径主要经呼吸道传播.

伊朗在野生禽鸟中检出禽流感病毒

2006年2月14日和15日，伊朗农业圣战部向OIE紧急报告，2月2日，拉什特市在野生禽鸟中发生H5N1亚型禽流感。涉及的易感动物有野生禽鸟3000只，其中153只发病或死亡。诊断性质为实验室检验。