环介导等温扩增技术(LAMP)检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用

为快速高效地检测人星状病毒,建立了一种新的试验方法——环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification technology,LAMP),并对人星状病毒LAMP反应条件进行了优化。结果表明,镁离子终浓度为4mmol·L-1、甜菜碱终浓度为1mol·L-1的25μL体系下65℃反应90min为其最佳反应条件。对扩增终产物进一步进行酶切分析得到的条带大小与预期的结果(84和135bp)吻合,以人星状病毒、轮状病毒及诺如病毒为模板进行特异性测试亦没有发生交叉反应。将人星状病毒质粒等倍稀释后分别用LAMP及聚合酶链式反应(PCR)检测其灵敏度,结果表明,LAMP与PCR的灵敏度分别达到5.04copies·μL-1和50.4copies·μL-1。用改良的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)及逆转录PCR(RT-PCR)检测12个再生水水样,其中人星状病毒检出率为分别为41.7%(5/12)和33.3%(4/12)。以上结果证明,LAMP是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的检测手段,在人星状病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

人星状病毒1型衣壳蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体制备的研究

目的表达纯化人星状病毒1型(HAstV-1)衣壳蛋白VP26片段,制备多克隆抗体,初步建立夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测病毒抗原方法,为进一步大量表达VP26片段、构建基因工程疫苗和临床检测奠定基础。方法利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP26蛋白,并以Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二噻啉甲酸法(BCA)实验、Western blot等方法对重组蛋白纯度、浓度、抗原性进行评价鉴定。以重组VP26蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳兔获得多抗血清并对其效价、特异性用ELISA鉴定。结果原核表达载体pET30a(+)-VP26构建成功,重组VP26蛋白可在大肠杆菌Rosetta 2宿主菌中大量表达。免疫兔所得多抗血清效价达到1∶8 000,可以满足夹心法ELISA实验的需要。结论HAstV-1衣壳蛋白原核表达系统建立和多克隆抗体制备可以作为今后相关研究的基础,有助于对HAstV-1感染致病机制、免疫诊断和疫苗研制的更深入研究。

人星状病毒临床分离株感染CaCo-2细胞的转录组分析

人星状病毒（human astrovirus,HAstV）是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,但其致病机制及与宿主相互作用的数据非常有限。本研究旨在了解HAstV感染细胞后对宿主基因在转录水平上的影响。首先,利用临床分离HAstV毒株感染CaCo-2细胞,用实时定量反转录-聚合酶链反应（reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR）检测细胞培养上清液中的病毒总RNA,结果显示接种后9~24h病毒总RNA拷贝数明显增加。然后,利用转录组测序全面比较感染与未感染HAstV的CaCo-2细胞转录本,筛选两者间的差异表达基因;并应用KEGG信号通路富集性方法分析差异表达基因相关的信号通路。结果显示,差异基因富集在两条信号通路上（P〈0.05）,分别为轴突导向通路和Ras信号通路。本研究首次利用深度测序技术分析了HAstV感染对宿主基因在转录水平上的影响,为进一步研究HAstV致病机制等提供了方向。

2013年南宁市某医院2岁以下腹泻患儿诺如病毒和人星状病毒感染分析

目的了解南宁市2岁以下腹泻患儿诺如病毒(No V)和人星状病毒(HAstV)的感染情况。方法收集2013年南宁市某医院儿科门诊2岁以下腹泻患儿粪便标本,采用实时荧光PCR法进行No V和HAstV检测。结果 201份粪便标本中No V和HAstV检出率分别为11.4%(23/201)和3.0%(6/201),两种病毒混合感染率为1.0%(2/201),No V检出率在8~10月出现高峰,50%的HAstV阳性病例分布在1~3月。结论 No V和HAstV均为南宁市2岁以下腹泻患儿的重要病原,其中No V检出率与先前研究相比明显下降,HAstV检出率则处于较低水平,推测本地区婴幼儿No V感染高峰期可能为夏秋季节,HAstV感染则可能多发于冬春季节。

逆转录环介导等温扩增检测人星状病毒1型

目的:建立一种快速检测人星状病毒1型的逆转录环介导等温扩增方法。方法:针对人星状病毒ORF1a序列设计特异引物,并优化反应条件。对1株人星状病毒1型实验株和7株其他肠道病毒对照株,及80份临床粪便标本进行检测,并与RT-PCR法比较,确定该方法的特异性、灵敏性和实用性。结果:60℃反应需时1.5h,可通过肉眼目测或电泳检测判定结果。该方法特异性较好,粪便标本中人星状病毒1型检出限为5pg/管。临床粪便标本检测结果与RT-PCR法一致。结论:本方法实用性强,有望用于人星状病毒1型现场监测和流行病学调查。

吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒腹泻的分子流行病学研究

目的:研究吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒(HAstV)腹泻流行情况和分子特征。方法:对吉林地区417份和兰州地区290份腹泻标本采用one-step PCR方法检测HAstV,用HAstV基因组ORF1b区部分核苷酸片段初筛,再用ORF2区部分核苷酸序列分型。结果:707份腹泻标本中共检出HAstV阳性17例,总阳性率为2.4%,其中吉林地区和兰州地区分别检出7例和10例。12份HAstV ORF2区阳性的样本均为HAstV 1型,除1株属于Lineage 1a群,其他均属于Lineage 1b群。HAstV主要感染2岁以下婴幼儿,在吉林春季为主要流行季节,而在兰州春季和秋季为主要流行季节。结论:HAstV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原之一,HAstV 1型是主要的流行株,2岁以下为感染发病的高危人群,不同地区HAstV流行季节不同。

人星状病毒Ⅰ型衣壳蛋白序列分析

目的分析人星状病毒Ⅰ型(human astroviruses 1,HAstV1)衣壳蛋白序列,预测其空间结构、理化参数及其生物学特性。方法选择Genebank序列号L23513中衣壳蛋白基因序列,联合应用生物软件DNAstar和互联网在线数据库分析其二级结构、三级结构、分子质量、理论等电点、氨基酸组成、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均疏水性、亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可及性等。结果 HAstV1衣壳蛋白空间构象比较规则,理化参数较稳定,具有较高的免疫原性。结论本研究分析了衣壳蛋白空间结构、理化参数和生物学特性,为人星状病毒的致病机制的研究及其防治与检测奠定了基础。

婴幼儿人星状病毒感染性腹泻的研究现状

腹泻是导致发展中国家儿童发病率及病死率较高的重要病因之一[1]。病毒为常见病原体,包括轮状病毒、诺如病毒、星状病毒、腺病毒等[2]。人星状病毒（Human astrovirus,HAstrV）是仅次于轮状病毒及诺如病毒的引起哺乳类及鸟类动物胃肠炎的重要病原体。1975年Appleton利用电镜在腹泻儿童粪便标本中发现人星状病毒,同年Madeley和Cosgrove将该病毒命名为星状病毒[3],因其病毒表面在电镜下可见5-6个星状突起。

人星状病毒核酸检测方法的建立及应用

目的:建立人星状病毒的实时荧光定量RT-qPCR检测方法,检测胃肠道感染患儿标本中的HAstV。方法:设计HAstV ORF2基因的引物和Taqman探针,扩增ORF2基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品,建立RT-qPCR检测方法,进行线性、准确性、特异性试验,并检测195份临床标本。结果:建立的RT-qPCR方法线性范围良好,准确性100%,对临床其他消化道病毒特异性好,195份临床标本中HAstV检测阳性15份,阳性率为7.7%。结论:成功建立了HAstV实时荧光定量RT-qPCR检测方法,并应用于临床标本的检测,为人星状病毒感染的临床治疗打下坚实的基础。

食品中人星状病毒的定量检测方法

目的:应用一步法微滴数字PCR方法(RT-ddPCR),建立一种食品中人星状病毒(HAstV)定量检测方法。方法:筛选引物探针,建立HAstV RT-ddPCR方法;利用其它常见食源性病毒RNA,确定特异性;梯度稀释HAV RNA标准样品确定检测限、准确度和重复性。用已知效价的MS2噬菌体制备人工污染样品,研究RT-ddPCR方法在不同种类食品基质中的检测限和回收率,比较2种RNA提取方法的病毒检出量。结果:HAstV RT-ddPCR方法准确度、灵敏度和重复性良好,检测限105~100拷贝/μL,最低定量限5拷贝/μL;不同种类食品基质的检测限分别为7.2×106~3600拷贝(贝类消化腺),7.2×106~3600拷贝(硬表面食品),7.2×106~7200拷贝(生食蔬菜)、7.2×107~7200拷贝(软质水果);高浓度污染剂量时,Trizol裂解结合磁珠纯化方法病毒检出量显著低于Trizol裂解提取方法(P<0.05);不同种类食品基质中模拟病毒回收率存在显著差异(P<0.05)。结论:本研究建立的食品中HAstV定量检测方法可有效定量检测HAstV,可通过病毒回收率计算样品中HAstV的实际载量。

人星状病毒1型野毒株的培养及生物学鉴定

目的研究人星状病毒1(HAst V-1)型野毒株的分离方法、细胞培养适应条件及相应生物学性质。方法对收集的腹泻粪便样品,采用间接酶联免疫吸附法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行HAst V检测。阳性样品按常规方法处理,并进行细胞培养分离及最佳培养条件确定,将毒株连续传10代,采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫荧光法检测病毒的增殖,细胞荧光灶法进行滴度测定,采用RT-PCR进行特异性基因组稳定性检测。结果通过检测野毒株为HAst V-1d亚型。将其中编号为JZ-10的毒株进行传代培养。该毒株在传代过程中无明显细胞病变,在人结肠癌细胞株(Caco-2)中传代适应培养10代(P10)后,病毒能够稳定增殖并具有良好的识别HAst V抗体的能力。随着传代次数增加,病毒基因拷贝数与病毒滴度增加,P10代病毒基因拷贝数达2.7×107,病毒感染性滴度达6.97 log FFU/ml。在传代过程中,病毒基因组核酸序列稳定,无突变。结论该实验获得HAst V-1型JZ-10细胞适应毒株,为后续进行该病毒的基础研究奠定基础。

山东省11株人星状病毒的全基因组序列特征分析

目的了解山东省人星状病毒(HAstV)的全基因组特征。方法收集山东省2020—2022年急性弛缓性麻痹病例监测系统的粪便标本,采用实时荧光定量PCR检测HAstV核酸,针对阳性标本应用下一代测序技术对HAstV的全基因组序列进行测定和分析,进行型别鉴定,使用BioEdit和Mega软件进行同源性比较和系统发生学分析。结果共检测了667份标本,14份为HAstV核酸阳性(2.1%),其中HAstV-1基因型6份,MLB1基因型6份,MLB2基因型1份,VA2基因型1份。共有11份标本获得了全基因组序列。其中,6株HAstV-1型本地序列之间的核苷酸相似性为98.2%~99.9%,与其他地区HAstV-1的全基因组序列的核苷酸相似性为87.6%~98.6%;4株MLB1型本地序列之间的核苷酸相似性为99.1%~99.9%,与其他地区的MLB1型全基因组序列相似性为92.2%~99.4%;1株VA2型本地序列与其他VA2型全基因组序列相似性为96.0%~96.3%。基于ORF2编码区的系统发生学结果显示,HAstV-1型本地序列与日本株具有较为密切的亲缘关系,且与基于ORF1a、ORF1b序列的系统发生树拓扑结构不一致。结论共获得11株HAstV的全基因组序列,并发现了VA2型序列。

2010-2020年江西省腹泻儿童人星状病毒感染情况及基因型分析

目的了解2010—2020年江西省腹泻儿童人星状病毒的感染情况以及病毒基因型。方法收集2010—2020年江西省儿童医院15岁以下腹泻儿童的粪便标本,使用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应进行人星状病毒核酸检测,对人星状病毒核酸阳性的标本采用反转录聚合酶链式反应对ORF2基因部分区域扩增并进行序列测定分析。结果2010—2020年共采集粪便标本2403份,检出人星状病毒核酸的标本72份,总阳性率为3.00%,5岁以下年龄组的阳性率为3.03%,2岁以下年龄组的感染者占比为84.72%;人星状病毒在同年11月至次年3月的检出率较高;基因测序获得47条病毒ORF2区序列,经比对分析,其中基因1型38条,基因2型1条,基因4型3条,基因5型1条,基因6型4条。结论人星状病毒是引起2岁以下儿童腹泻的重要病原体,2010—2020年江西省流行的星状病毒主要为基因1型,2010年亦存在基因6型的流行。

二代测序技术分析2018年济南市污水中的人星状病毒基因特征

人星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是引起急性胃肠炎的主要致病病毒之一,为了解HAstV的型别分布和遗传变异特征,本研究于2018年在济南市按月采集12份生活污水样本,浓缩处理后提取RNA,进行HAstV部分ORF2编码区的PCR扩增,阳性产物进行下一代测序(Next generation sequencing, NGS)分析,探索HAstV各型别的动态变化和系统发生学特征。结果显示所有污水中均检出HAstV核酸,NGS分析显示所测读长分属于HAstV-1至HAstV-6共6个型别,其中HAstV-1型占比最大(27.4%),但不同月份的优势型别有所差别。系统发生学分析显示HAstV-1、HAstV-2、HAstV-5型山东株序列属于多个遗传分支,提示这些型别有多个传播链在当地循环。本研究描述了2018年济南市本地流行的人星状病毒基因型分布和序列特征,研究结果证明基于扩增子NGS的环境监测是探索人群中HAstV分子流行病学特征的有效手段。

基于下一代测序的污水中人星状病毒分子流行病学研究

目的了解生活污水中人星状病毒(HAstV)的型别分布及遗传多样性。方法2018年1月—2019年6月在山东省济宁市按季度采集6份生活污水样本,通过阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩后,提取核酸,进行ORF2完整编码区的RT-PCR扩增及扩增产物下一代测序,对产生的干净数据使用CLC Genomics Workbench 12.0软件de novo组装后,进行基因定型、同源性比较和系统发生学分析。结果检测地区生活污水中HAstV的检出率为100%,共获得HAstV序列43条,分属9种基因型,分别为HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-4、HAstV-5等经典型和MLB1、VA1、VA2、VA3等新型HAstV,其中HAstV-5(47.53%)占比最高;基于ORF2完整编码区的系统发生学显示山东株与国内外其他参考株在一些分支上聚集在一起,表明不同型别在世界不同地区的传播。结论本研究证实了基于NGS的环境监测有助于提高对HAstV遗传多样性的认识。

人星状病毒研究进展

人星状病毒是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,本文回顾了其分子生物学特征、型别、所致疾病特征、致病机制、流行病学特征及检测方法等方面的文献,指出人星状病毒目前存在多种型别,尤其是近年来发现了多种新型的星状病毒,主要的流行型别是血清型1型,不仅引起肠道内感染,还可以引起其他系统疾病,所致疾病特征和其他腹泻相关病毒相似,但是其致病机制的研究尚不清楚,对于几种新发现的星状病毒,其与疾病的相关性研究较少,且未建立完善的实验室检测方法,还需要进一步的研究。

人星状病毒非结构蛋白nsP1 a／1相互作用的宿主细胞靶蛋白筛选

目的：利用细菌双杂交技术筛选与人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1相互作用的蛋白。方法培养人肠道细胞HT29，提取基因组，利用细菌双杂交系统载体pUT18 C构建HT29基因组文库，同时构建诱饵载体nsP1a／1-pKT25。将文库和诱饵载体共转化进入细菌BTH101，在M63培养基上进行筛选。结果通过酶切鉴定以及测序分析，诱饵载体构建正确，并且利用细菌双杂交技术成功从HT29细胞基因组文库中筛选出能与人星状病毒非结构蛋白 nsP1a／1相互作用的蛋白。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1的诱饵载体，在HT29细胞基因组文库中筛选得到了3个与nsP1a／1相互作用的蛋白，为进一步研究人星状病毒在细胞内的增殖和防治药物的应用奠定基础。

南宁市腹泻患儿人星状病毒检测及基因特征分析

目的了解南宁市腹泻患儿人星状病毒的基因特征。方法收集2013年南宁市某医院儿科门诊腹泻患儿粪便标本201份,采用实时荧光PCR法进行人星状病毒检测,阳性标本再用PCR方法扩增开放读码框2(open reading frame2,ORF2)部分片段并送测序,通过Blast比对和系统进化树分析序列的基因特征。结果 201份粪便标本中检出6份星状病毒阳性,检出率3.0%(6/201);其中5株测序成功,经Blast比对显示2株为1型,其余3株分别为2、4和5型,系统进化树分析发现1型均为lineage 1a,2型为lineage 2c,4型为lineage 4a,5型毒株与参考株的同源性为94.0%~99.0%,不进行lineage划分。结论南宁市腹泻患儿存在人星状病毒感染,其基因型呈多样性分布。

吉林省2017—2020年腹泻婴幼儿中人星状病毒分子流行病学特征

目的了解吉林省2017—2020年婴幼儿腹泻患者中人星状病毒(human astrovirus,HAstV)的分子流行特征。方法采集2017年1月至2020年12月小于5岁腹泻住院婴幼儿粪便标本,用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法将粪便标本核酸进行扩增,对阳性扩增产物进行序列测定,构建系统进化树。结果收集粪便标本共2019份,HAstV阳性总数71份,阳性率3.5%。HAstV阳性标本中,42份存在与其他腹泻病毒的混合感染,占阳性总数的59.2%,其中50%为轮状病毒(rotavirus,RV)和HAstV的混合感染。2017—2020年HAstV检出阳性率分别为4.69%、1.98%、5.93%、0.43%,每年出现2个流行高峰,每2年出现1次流行高峰年。36~47月龄阳性率最高,其次是0~2月龄。共获得55份序列,经过系统进化树分析显示,均属于经典型HAstV,其中42株HAstV-1a亚型,8株HAstV-1b亚型,5株HAstV-5型。结论HAstV是吉林省5岁以下儿童腹泻的重要病原之一,流行规律有明显的季节和年龄差异,流行优势株以HAstV-1a型为主。

2017年深圳市宝安区一起人星状病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情调查

目的探讨2017年深圳市宝安区一起学校急性胃肠炎暴发疫情的病原体和传播危险因素。方法2017年10-11月,按照定义搜索深圳市宝安区某学校一起急性胃肠炎暴发疫情病例,采用描述性流行病学方法进行分析,并选择罹患率较高的5个班级作为调查对象,采用回顾性队列研究方法,调查269名学生的病例接触史、就餐、饮水习惯等暴露情况,用logistic回归分析其流行因素。采集患者的粪便或肛拭子,以及直饮机水、桶装水、厕所洗手水等水样,运用试剂盒检测病毒核酸。结果2017年10月20日至11月17日,共搜集病例98例,总罹患率为3.21%(98/3052),男、女性罹患率分别为3.59%(61/1698)和2.73%(37/1354),差异无统计学意义(χ^2=1.782,P=0.181)。第三教学楼学生罹患率最高,为3.94%(6/152),其次是主教学楼学生,罹患率为3.62%(84/2319)。各教学楼学生罹患率差异有统计学意义(χ^2=7.837,P=0.049),主教学楼不同楼层学生罹患率的差异无统计学意义(χ^2=1.861,P=0.713)。回顾性队列研究共调查269人,饮直饮水(RR=6.975,95%CI:1.871~26.027)和接触病例(RR=6.514,95%CI:2.314~18.358)是危险因素。粪便和肛拭子样本星状病毒核酸检测总阳性率为28.00%(7/25),水样本均阴性。结论结合现场流行病学调查和实验室检测结果,判断为一起主要通过接触传播引起的人星状病毒感染暴发疫情,建议学校早发现、早隔离、早报告,尽可能减少健康学生接触病例。