苯并呋喃羧酸类特异性尿酸盐转运体抑制剂的设计、合成及活性研究

目的:设计合成新型的、具有一定特异性的苯并呋喃类人尿酸盐转运体(human urate anion transporter-1,h URAT1)抑制剂,并对其进行活性测试。方法:以苯并呋喃为骨架,引入羧基,设计合成3个新化合物。将所得目标化合物分别对稳定转染h URAT1基因或人有机阴离子转运体(human organic anion transporter-1,h OAT1)基因的MDCK细胞进行[^(14)C]尿酸摄取抑制试验或6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-CFL)试验,探究化合物抑制细胞尿酸或6-CFL摄取能力。结果:成功合成了目标化合物B-1,B-2,B-3,并经过1H-NMR,MS的结构确证。体外h URAT1和h OAT1抑制活性筛选的结果显示,单羧酸化合物B-1,B-2具有较强的抑制h URAT1[14C]尿酸摄取活性,且化合物B-1表现出良好的h URAT1选择性。结论:设计合成了新型的具有一定h URAT1特异性的降尿酸化合物,化合物B-1的抑制活性及选择性均优于阳性对照药丙磺舒。

稳定表达hOAT1的HEK293细胞系的建立及鉴定

目的构建人肾脏近曲小管阴离子转运体1(human organic anion transporter 1,hOAT1)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒,获得稳定表达pEGFP-hOAT1的HEK-293细胞系。方法构建EGFP与hOAT1的融合基因表达载体pEGFP-hOAT1,并利用FuGENE 6转染试剂将其转染至HEK293细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,经G418抗性筛选获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术,检测稳定转染细胞及正常细胞hOAT1 mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力,以及丙磺舒对hOAT1的抑制作用。结果使用该文的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot,以及对氨基马尿酸摄取、丙磺舒抑制实验结果显示,相对于正常组,转染细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光,其hOAT1表达均呈阳性(P<0.01);稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力明显升高(P<0.05),且丙磺舒对hOAT1有明显的抑制作用(P<0.05)。结论高效快速地建立了稳定高表达hOAT1的HEK293细胞系,为核苷类膦酸类似物这类药物引起的临床剂量依赖性肾毒性的机制研究奠定了模型基础,也为体外研究hOAT1底物或抑制剂的筛选提供了一个便利的工具。