靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,WJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人木糖基转移酶(XT-I)蛋白的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位,从中选择优势抗原表位,通过引物优化设计,PCR拼接并扩增相应区域DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌ER2566,获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体,ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体,采用Westernblot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果:确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG(175-205)为抗原表位,成功构建了重组表达载体,表达融合蛋白GST-XT,并以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1:640000;Westernblot结果显示:该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论:获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体,为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。