小球藻多糖对人树突状细胞成熟的作用和机制研究

目的:探讨小球藻多糖(PFC)对人树突状细胞(DC)的成熟作用及其相关机制的初步研究。方法:使用纯化后的PFC对外周血单核细胞来源的不成熟DC进行干预,使用流式细胞术检测PFC干预后DC表面CD83和CD86表达变化,利用酶联免疫法(ELISA)检测细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10水平的变化;继而通过比较PFC处理组和对照组的转录谱基因表达差异及通路富集分析,寻找其作用途径,并使用相关分子通路抑制剂进行初步验证。结果:PFC可上调DC表面CD83和CD86的表达,促进DC细胞因子IL-10的释放;生信分析结果提示PFC可能通过Toll样受体2/4(TLR2/4)发挥作用,利用TLR2和TLR4通路抑制剂下调了PFC诱导的DC CD86表达。其中TLR4抑制剂干预后CD86表达水平显著下降(P<0.05)。结论:PFC可能通过TLR2和TLR4通路上调人外周血单核细胞来源DC表面标志物CD83和CD86表达水平的提高,从而促进DC成熟。

二十二碳六烯酸对人树突状细胞基因表达谱的影响

目的:研究二十二碳六烯酸(DHA)对人树突状细胞 (DCs)成熟过程中基因表达谱的影响。 方法:采用GM CSF及IL 4诱导人外周血单核细胞获得非成熟DCs,经DHA( 50μmol/L)孵育 24h后,再予以LPS(100ng/ml)作用 48h,用cDNA芯片检测人DCs基因表达谱。用RT PCR法验证相关差异表达基因的结果。分别将未经脂肪酸处理的DCs和硬脂酸(SA)处理的DCs作为对照。 结果:经DHA预处理后,成熟的DCs与未经脂肪酸处理的成熟DCs相比,共有 20条基因差异表达 ,约占芯片中基因总数的 29. 4%。其中 18条基因表达下降, 2条基因表达增加。在差异表达的基因中,涉及细胞因子、趋化因子 (受体)及其抗原呈递相关分子基因等。而采用饱和脂肪酸(SA)处理的DCs的表达谱未见明显变化。 结论: 50μmol/LDHA对DCs成熟过程中的基因表达具有显著的影响 ,涉及到细胞因子、趋化因子(受体)及其抗原呈递相关分子基因的调节。

雷帕霉素对人树突状细胞功能的影响

目的 研究雷帕霉素 (RPM)对人树突状细胞 (DC)功能的影响。方法 分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)、白介素 4 (IL 4 )以及有或无RPM的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86 (B7 2 )的表达 ;混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力 ;ELISA法测定MLR上清液中的细胞因子。结果 与对照组比较 ,经RPM处理的DC表面CD86的表达明显降低 ;对T淋巴细胞刺激的能力下降 ;MLR中致炎细胞因子 (IL 1β ,IL 6 ,TNF a)浓度降低。RPM的这些作用呈浓度依赖性。 结论 雷帕霉素对人树突状细胞功能有明显的抑制作用 。

尼古丁对人树突状细胞的激活及其与急性冠状动脉综合征的关系

目的 :研究尼古丁对人树突状细胞 (DC)功能的影响及其与急性冠状动脉综合征 (ACS)发病的关系。方法 :观察体外尼古丁对DC功能的作用以及 11例正常对照者 (正常对照组 )与 45例ACS者 (ACS组 )发病时及戒烟后DC的功能状态。流式细胞仪检测DCCD86的表达 ;混合淋巴反应检测DC对T淋巴细胞的刺激作用 ;酶联免疫吸附法 (ELISA)测定混合淋巴反应上清液中细胞因子水平。结果 :与正常对照组比较 ,ACS时DC表面CD86的表达明显增高 ,对T淋巴细胞刺激的能力增强 ;致炎细胞因子分泌增多 ;DCCD86的表达与日吸烟量正相关 (r =0 63 ,P <0 0 1) ;平均戒烟 5个月后 ,DC功能接近正常 ;体外尼古丁亦能明显刺激DC的功能 ,呈浓度依赖性。结论 :①ACS时DC明显激活 ;②戒烟后DC功能可迅速恢复 ;③尼古丁可能是ACS时DC激活的刺激因素之一。

紫杉醇对人树突状细胞的生物活性的影响

目的探讨常用化疗药物紫杉醇(TAX)对人树突状细胞(DC)生物活性的影响及作用机制,为化疗联合生物免疫治疗抗肿瘤提供理论基础。方法体外实验:分别在紫杉醇5 ng/mL(b组)、10 ng/mL(c组)、20 ng/mL(d组)、40 ng/mL(e组)的浓度下及不加紫杉醇的条件下(a组)培养DC细胞,检测各组DC细胞的存活率、细胞成熟标志物及细胞因子分泌量,探究紫杉醇对人树突状细胞生物活性的影响,同时通过乳酸脱氢酶释放法(LDH)测定与紫杉醇处理的树突细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对肺癌A549细胞株的杀伤作用,测定紫杉醇对树突细胞抗原呈递作用的影响。体内实验:采用人肺癌细胞株A549的肿瘤组织块,皮下接种于裸鼠腋下,建立裸鼠肺癌模型。2 d后将30只裸鼠随机分成5组,分别为A组(对照组):细胞株A549+盐水(NS);B组:细胞株A549+DC+CIK;C组:细胞株A549+CIK+TAX;D组:细胞株A549+TAX;E组:细胞株A549+TAX+DC+CIK。每3天检测1次肿瘤大小、裸鼠存活时间。结果体外实验:在共培养6 d的前提下,b、c组第6天存活率与第0天存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05),d、e组第6天存活率与第0天存活率比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),e组存活率仅为17.5%。c组和e组CD86、CD40、MHCⅡ的表达以及IL-12的分泌与正常组相比有显著增加(P<0.05),d组除了CD86,其他检测指标较正常组差异均有统计学意义,b组中只有MHCⅡ较正常组差异有统计学意义,经10 ng/mL紫杉醇处理的细胞在效靶比5:1和10:1的情况下,杀伤效果明显高于未经紫杉醇处理的细胞。其中紫杉醇处理组的细胞在效靶比为10:1的情况下,杀伤活性已经到达(91.37±5.24)%。体内实验:B、C、D、E组的平均存活时间分别为33.0、34.0、31.8、41.8 d,明显高于对照A组(23.8 d)(P<0.05)。E组平均存活时间大于41.8 d,明显高于B、C、D组(P<0.01),其中E组中,45 d仍有3只存活,D组在前25 d体现出较好的治疗效果,但是25 d后瘤体增长速度增加,与B组差异无统计学意义。结论低中浓度的紫杉醇可促进树突状细胞的成熟并提高其抗原呈递能力。高浓度紫杉醇可杀死树突状细胞,抑制其免疫活性。中浓度紫杉醇能促进树突状细胞分泌白介素12。紫杉醇、DC、CIK联合应用可提高荷瘤裸鼠生存时间。

人IL-6、TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞的影响

目的:探讨IL-6和TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞(DC)的影响。方法:从人外周血中常规分离单核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导成DC并进行形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力的鉴定。用不同浓度的IL-6、TNF-α作用于Ⅱ型登革病毒(DV2)感染的DCs,于感染后6、24、48、72、96h收集上清,采用甲基纤维素微量病毒空斑法检测病毒的滴度,以MTT比色法测定IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量的变化。结果:中、低浓度的IL-6对DC中DV2的增殖均有增强作用;高、中浓度的TNF-α对DC中DV2的增殖具有抑制作用。IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量无明显影响。结论:IL-6和TNF-α通过对DC的影响在DV2感染中具有重要作用。

登革病毒对人树突状细胞感染性的研究

探讨登革病毒对人树突状细胞(DC)的感染性。人外周新鲜血常规分离单核细胞,经细胞因子GMCSF、IL4诱导培养成DC,通过形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。用登革病毒2型(DV2)感染DC,于作用后6h、24h、48h、72h、96h分别收集上清液和细胞,甲基纤维素微量空斑试验测定病毒滴度,间接免疫荧光法检测细胞上病毒抗原表达,透射电镜观察病毒在细胞内的定位。病毒感染后6h即可在培养上清中测出病毒,病毒滴度在48h达到高峰,以后逐渐下降。间接免疫荧光法证明感染的DC胞浆及胞膜上携带病毒抗原。透射电镜下在病毒感染48h后DC胞浆内可见大量病毒颗粒。树突状细胞是登革病毒感染的靶细胞,病毒可感染DC并产生大量病毒颗粒,可能在其发病机制中起重要作用。

负载肝癌抗原的人树突状细胞生物学特性的研究

目的 探讨负载肝癌抗原的树突状细胞 (DC)对自身CIK细胞的诱导增殖能力和杀伤能力 .方法 从人外周血分离获得单核细胞 ,体外经重组细胞因子 (GM -CSF)、白细胞介素 - 4 (IL - 4 )、肿瘤坏死因子α(TNF -α)培养获得DC ,电镜观察其形态 ,流式细胞仪检测其表面抗原 ,混合淋巴细胞反应检测负载肝癌抗原DC诱导CIK细胞增殖活性 ,检测激活的CIK对肝癌细胞的杀伤作用 .结果 经体外培养 ,从外周血分离获得的大量成熟DC ,检测表明高表达DC的抗原标志 ,负载抗原的DC具有很强的激发同种CIK增殖的能力 ,激活的CIK对肝癌细胞系具有很强的杀伤作用.结论 实验结果为肝癌的临床免疫治疗提供了理论基础 .

HCoV-OC43逃避人树突状细胞免疫清除机制的初步研究

目的:了解人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)逃避人树突状细胞(Dendritic cell,DC)免疫监视作用的初步机制。方法:利用HCoV-OC43阳性病人的标本感染BSC-1细胞分离OC43病毒,相差显微镜观察细胞病变(Cytopathic effect,CPE),实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)进行鉴定;利用人细胞因子GM-CSF和IL-4联合体外诱导DC分化,于诱导7 d后用HCoV-OC43病毒感染DC。采用透射电镜观察DC感染后的形态,Real-time PCR检测DC功能相关细胞因子的表达水平;流式细胞术检测DC比例及其功能相关共刺激分子的表达。结果:成功建立HCoV-OC43体外感染DC的体系。HCoV-OC43能感染DC并刺激其产生免疫应答,但培养上清中不能检测到病毒核酸;HCoV-OC43感染会导致DC细胞表达IFN-α、IFN-β、CCL3和CCL5的量显著下调,但其共刺激分子HLA-DR、CD1c和CD86的表达不受抑制。结论:HCoVOC43可感染人DC细胞并刺激其产生免疫应答,但不能产生活的子代病毒;HCoV-OC43可通过抑制宿主DC细胞IFN-α等相关炎症因子和趋化因子的分泌,来实现免疫逃逸。

Gamma射线照射对体外培养人树突状细胞表型的影响

目的 :了解Gamma射线照射是否影响体外培养的人树突状细胞的表型。方法 :利用含有重组的人GM CSF(80 0U/ml)和IL 4(50 0U/ml)的RPMI 1 640培养基从人的外周血单个核细胞 (PBMC)诱生树突状细胞 (DC)。在培养的第 6d加入 5mg/L的脂多糖 (LPS)继续培养 2 4h促使DC完全成熟 ,于第 7d收获DC并分成 2部分 ,一部分未经Gamma射线照射的DC用作对照组 ,另一部分的DC用 30Gy剂量的Gamma射线照射。采用流式细胞仪分析DC的表面分子。结果 :Gamma射线照射减少树突状细胞CD86 ,CD80和HLA DR ,尤其是CD86分子的表达 (P =0 .0 0 72 )。结论

转染癌胚抗原基因的人树突状细胞疫苗表达的研究

目的 探索使用质粒转导制备转基因DCs疫苗的方法。方法 采用细胞因子rhIL 4和rhGM CSF诱导培养法制备人外周血树突状细胞 ,用Lipofectine向人DCs转染含人CEA真核表达质粒。结果 转染组DCs培养上清CEA含量明显高于未转染组培养上清CEA含量。

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

目的 :探讨获得大量人树突状细胞的方法。方法 :采用密度梯度离心加细胞因子rhIL 4和rhGM CSF诱生法。结论 :用该方法可获得大量的人树突状细胞。

人树突状细胞与肺癌细胞A-549融合疫苗生物学特性研究

目的探讨人树突状细胞(DC)与人肺癌细胞A-549融合所得疫苗在制备过程中的生物学特性,总结高效制备融合疫苗的方法。方法应用GM-CSF和IL-4优化的方法制备肺癌患者人外周血单核细胞以获得DC,寻找DC制备率最高时间段;同时应用PKH672GL(绿色荧光)和PKH262GL(红荧光)分别标记DC和肺癌细胞A-549细胞,筛查最佳的融合比例。结果应用GM-CSF和IL4优化法进行DC制备第7天所得百分率为(66.26±5.13)%,高于其他时间(P<0.05);通过对比不同融合比例DC与人肺癌细胞A-549,显示1:1时所取得的融合百分率为(35.15±2.16)%,高于其他比例(P<0.05)。结论在DC制备过程中制备第7天所得DC百分率最高,应选取此时作为提取DC的最佳时间;同时DC与人肺癌细胞A-549以1:1比例相融合所得疫苗百分率最高。

葡聚糖磁性纳米颗粒在基因转染人树突状细胞中的研究

目的评价葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体在针对人树突状细胞转染中的可行性。方法用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法分析检测葡聚糖磁性纳米颗粒结合DNA的能力,再将葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体连接绿色荧光蛋白pEGFPC1质粒报告基因在体外转染人树突状细胞,并在转染后72h采用MTT比色法测定这种载体对人树突状细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果在葡聚糖磁性纳米颗粒表面修饰多聚赖氨酸后,以静电引力作用结合DNA,其DNA结合率可达到75.6%,修饰多聚赖氨酸的葡聚糖磁性纳米颗粒可作为基因载体将报告基因转染至人树突状细胞内并成功表达,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光细胞。与相同条件下脂质体为对照,转染后的人树突状细胞的增殖活性及功能略优于对照组,有效的证明了葡聚糖磁性纳米颗粒的细胞毒性稍低于脂质体的细胞毒性。结论葡聚糖磁性纳米颗粒可作为有效转染人树突状细胞的基因载体之一。

人树突状细胞与肝癌细胞系HLE融合细胞的构建

目的构建人源树突状细胞(DC)与肝癌细胞系HLE的融合细胞。方法含15%FCS的RPMI1640培养HLE细胞,用GMCSF和IL4培养成人外周血单核细胞7d,并用TNFα和PGE2促成熟2d后获得成熟DC;用荧光染料PKH67GL(绿色荧光)和PKH26GL(红色荧光)分别标记DC和HLE细胞,以50%聚乙二醇和10%二甲基亚砜为融合剂,构建可供流式细胞仪快速筛选的融合细胞。结果成功构建具有红、绿双色荧光的人源DC与HLE的融合细胞,融合率为16.8%。结论利用PKH67GL和PKH26GL为标记,可获得便于快速识别和筛选的DC与肝癌细胞的融合细胞,为使用融合DC疫苗治疗肝癌奠定了基础。

人树突状细胞体外经HBsAg刺激后的抗病毒作用

目的观察人树突状细胞(DCs)经表面抗原(HBsAg)刺激、体外诱导自身特异性T淋巴细胞增殖后,对2.2.15细胞中HBeAg和HBsAg的特异性免疫抑制作用。方法 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-a)分化、诱导人外周血PBMC中的DCs,在DCs成熟前加入纯的HBsAg刺激,将成熟后的DCs体外与自身T淋巴细胞共培养,同时不加HBsAg刺激的DCs与T细胞共培养、T细胞加纯的HBsAg共培养以及单纯T细胞作对照,5 d后收集T细胞,分组加入2.2.15细胞培养液中,分别收集第1天、3天、5天和7天的培养上清液,检测其HBeAg和HBsAg的分泌情况。结果经抗原刺激后的DCs可以有效提呈病毒抗原,正常人与慢性乙肝患者负载抗原后的DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力[cpm分别为(46 700±7 850)和(38 628±5 427)]明显高于未负载抗原的DCs[cpm分别为(40 450±4 645和33 924±4 498)]及对照组PBMC[cpm分别为(5 947±476)和(5 089±233)],P<0.01。负载抗原的DCs有强烈的免疫应答活性,并且其免疫刺激能力似乎与负载的抗原量成正比;经抗原刺激激活的T细胞可以有效地抑制HBeAg的表达,但对HBsAg未发现有明显的抑制作用。结论体外经HBsAg刺激后的DCs可有效地提呈病毒抗原,并可进一步激活T细胞产生,同时能显著地抑制2.2.15细胞上清?

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的:研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞(DC)的可行性,以及在体外诱导特异性抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。方法:以葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)作为载体,在多聚赖氨酸(PLL)的辅助下,通过静电作用结合MUC1/Y基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1/Y,在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显微镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MUC1/Y特异性抗膀胱癌(膀胱肿瘤BIU87细胞系)的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况;ELISA法测定基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力。结果:pEGFP-C1/-MUC1/Y转染效率为15%左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出显著的MUC1/Y特异性的CTL,对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52%,显著高于对照组T-DC诱导的CTL;在透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。

维生素D_3及其类似物对人树突状细胞表达CSF-1及其受体的作用

目的 探讨维生素D3[1,2 5 (OH) 2 D3]及其类似物抑制人树突状细胞分化 ,但保持细胞生存是否通过调节集落刺激因子 (CSF 1)及其受体来实现。方法 在体外将人外周血单核细胞分化成树突状细胞。采用流式细胞术、RT PCR和ELISA法分析 1,2 5 (OH) 2 D3及其类似物对树突状细胞表达和产生CSF 1及其受体的作用。结果 1,2 5 (OH) 2 D3和他骨化醇 (tacalcitol)以剂量依赖的方式显著上调树突状细胞对CSF 1mRNA的表达 ,并增高其蛋白分泌水平 ,而细胞表面CSF 1受体以及mRNA的表达均受到抑制。溶剂乙醇和 2 4 ,2 5 (OH) 2 D3对CSF 1及其受体均无调节作用。 1,2 5 (OH) 2 D3对树突状细胞表达GM CSF受体mRNA无影响。结论 1,2 5 (OH) 2 D3对树突状细胞分化的抑制与其特异性地调节CSF 1及其受体有关。