人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

目的:制备人核迁移蛋白(hNudC)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:从人胎肝组织中克隆得到hNudC基因,构建重组表达质粒pET-28b/hNudC,表达带有6-His标记的重组hNudC,用纯化的重组hNudC蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb,用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆,用免疫荧光染色法及Western blot试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应,免疫荧光染色和Western blot试验证明,制备的mAb可以识别人巨核系白血病细胞株Dami、Meg-01和人脐带血来源的CD41+巨核细胞中表达的hNudC蛋白。结论:成功地制备了特异性抗hNudC mAb,为研究hNudC蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。

用流式细胞仪进行人核迁移蛋白shRNA有效干扰片段的分析和筛选

目的为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H。方法将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体;将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.载体中;将shNUDC-A、B、C、D、E、F、H各个片段分别克隆至含有U6启动子的载体中,形成一系列RNA干扰载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H;将提取高质量的质粒通过脂质体方法转染293T细胞。用流式细胞仪分析转染的293T细胞的荧光强度和荧光细胞数量,用实时荧光相对定量RT-PCR(real-time PCR)检测NUDC-RFP mRNA的转录情况,用Western Blot法检测NUDC-RFP融合蛋白的表达水平。结果流式细胞仪检测结果显示:空白对照组的293T细胞无发光细胞;阴性对照组的293T细胞能正常发光,且发光细胞数量较多;实验组的293T细胞发光细胞数量少,荧光强度低,说明其能有效干扰NUDC-RFP融合基因的表达,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F干扰下调效果约90%左右;pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A可干扰hNUDC-RFP融合基因的表达,下调效果约85%左右;其他干扰片段pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H下调效果在62%～75%;阴性对照组对融合基因无干扰效果;流式细胞仪检测结果与real-time PCR检测结果一致,也与Western Blot法的鉴定结果基本符合,并确定了shNUDC-F为RNA干扰效果最佳的干扰片段。结论流式细胞仪分析方法是一种有效的带荧光标记的RNA干扰载体的筛选方法,为后期研究打下了基础。

人核迁移蛋白C与血小板生成素受体MPL的结合作用

目的研究人核迁移蛋白C(hNUDC)与血小板生成素受体MPL的结合作用。方法采用PCR技术,分别从人胚胎干细胞和pLexA-MPL-EC质粒中扩增hNUDC和MPL-EC基因,再分别克隆至pET-28b(+)和pMAL-c2表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达hNUDC和MPL-EC蛋白。纯化后,通过MBP pull-down试验检测二者的结合作用。结果表达的融合蛋白His-hNUDC和pMAL-MPL-EC表达量分别约占菌体总蛋白的25%和30%,蛋白回收率分别可达90%和80%,纯化后的蛋白纯度分别在95%和90%以上,且均具有良好的反应原性。His-hNUDC蛋白可与MBP-MPL-EC蛋白共洗脱,二者存在结合作用。结论hNUDC蛋白可与MPL蛋白结合,可能为MPL的一种新配体。

人核迁移蛋白C在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:明确鼻咽癌(NPC)组织中人核迁移蛋白C(hNudC)的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学方法和Western blot方法检测80例NPC和30例鼻咽黏膜慢性炎组织中hNudC的表达情况,并应用条带密度分析软件半定量分析Western blot条带密度。结果:在NPC中,hNudC阳性表达率为83.75%(67/80),明显高于鼻咽部黏膜慢性炎症组织23.33%(7/30)(P<0.05),hNudC蛋白的阳性表达率随着NPC临床分期的进展而增加(P<0.05)。结论:hNudC基因表达与NPC细胞恶性增殖密切相关,检测其表达对研究NPC的发生、发展具有一定临床意义。

人核迁移蛋C刺激人造血干细胞增殖分化为巨核细胞研究

目的:研究人核迁移蛋C(hNUDC)促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、分化为巨核细胞的作用。方法:使用DynalCD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞,无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12d后,显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、中、大巨核细胞集落的形态、数目的影响;无血清液体培养体系培养CD34+细胞10d后,流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果:hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFU-MK集落,可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达,CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论:hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。