过表达miR-29a对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响

目的探讨miR-29a在人椎间盘退变髓核(NP)细胞凋亡的调控作用。方法体外培养椎间盘退变NP细胞,构建重组真核表达质粒cherry/miR-29a,脂质体Lipofectamine转染进入NP细胞,应用反转录实时定量PCR(RT-qPCR)检测NP细胞中miR-29a的表达变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3前体的表达变化,流式细胞仪检测NP细胞凋亡水平变化。结果 NP细胞转染重组质粒cherry/miR-29a48h后,NP细胞中miR-29a的表达水平较NP细胞和转染空质粒的NP细胞中的miR-29a明显升高(P<0.05);凋亡相关蛋白Caspase-3前体的水平则明显下降(P<0.05);NP细胞凋亡水平明显升高(P<0.05)。结论在椎间盘NP细胞中过表达miR-29a能促进NP细胞凋亡,其机制可能是通过Caspase-3途径起作用。

miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性及凋亡的影响

目的:研究miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞增殖凋亡的调控机制。方法:运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测人椎间盘退缩患者组织和葡萄糖(5、1 mmoL/L)处理的椎间盘退变髓核细胞中miR-663b的表达;脂质体法将低糖组+miR-NC组(转染miR-NC)、低糖组+miR-663b组(转染miR-663b mimics)、低糖组+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、低糖组+anti-miR-663b组(转染anti-miR-663b)转染至1 mmoL/L处理的椎间盘退变髓核细胞。细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术、免疫印迹(Western blot)检测细胞的吸光度(OD)值、细胞的凋亡率、细胞中细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)的蛋白表达。结果:miR-663b在人椎间盘退缩患者组织和1 mmoL/L葡萄糖(低糖组)处理的椎间盘退变髓核细胞中的表达均明显降低(P<0.05)。低糖组细胞的增殖能力受到抑制,凋亡能力得到提升,并且P21和Caspase-3的蛋白表达量得到提升。过表达miR-663b的低糖组细胞中miR-663b表达明显升高,细胞增殖能力也明显升高,细胞凋亡能力则明显降低,P21和Caspase-3的蛋白表达量得到抑制,而抑制miR-663b的低糖组细胞则发生相反的作用。结论:miR-663b可促进低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的增殖,抑制凋亡。

MiRNA-326抑制人椎间盘退变髓核细胞活力和凋亡的机制

目的:探讨过表达miRNA-326对椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)髓核(nucleus pulposus,NP)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:构建miRNA-326慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miRNA-326-NP,同时设置空载体GV369-NP组与空白组。荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白[绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]的表达,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测miRNA-326的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miRNA-326与FasL的靶向关系,蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD,caspase-3,Bcl-2及Bax的表达,使用试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况。结果:荧光显微镜下示,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组未见绿色荧光。与空白组相比,GV369-miRNA-326-NP组中miRNA-326的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率,FADD,caspase-3和Bax的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);GV369-NP组与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miRNA-326与FasL存在靶向关系。结论:MiRNA-326可抑制IDD NP细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用。

苦参碱对椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡的影响

背景:髓核细胞凋亡是引发椎间盘退变的主要病理基础,炎症和过氧化反应是导致髓核细胞凋亡的重要因素。研究表明苦参碱具有抗氧化、衰老、炎症和细胞凋亡等作用,可作为治疗椎间盘退变的潜在药物。目的:观察苦参碱调节环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)信号通路对椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡的影响。方法:①将处于对数生长期的大鼠髓核细胞分6组处理:除对照组外,模型组、苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组、空载组、苦参碱高剂量+cGAS过表达组采用氧糖剥夺建立椎间盘退变细胞模型,造模同时苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组分别给予0.4,0.8 mmol/L苦参碱处理,空载组转染空载质粒,苦参碱高剂量+cGAS过表达组给予0.8 mmol/L苦参碱处理并转染cGAS过表达质粒。处理24 h后,检测细胞活性与凋亡,细胞内活性氧、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平,以及细胞内凋亡蛋白、cGAS-STING通路蛋白表达。②将60只SD大鼠随机分为6组,每组10只:除对照组外,模型组、苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组、空载组、苦参碱高剂量+cGAS过表达组建立椎间盘退变模型;造模12周后,苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组分别灌胃给予60,120 mg/kg苦参碱(1次/d),空载组尾静脉注射空载质粒(2次/周),苦参碱高剂量+cGAS过表达组灌胃给予120 mg/kg苦参碱+尾静脉注射cGAS过表达质粒,连续治疗3周。给药结束后取材,检测细胞凋亡,活性氧、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平,以及凋亡蛋白、cGAS-STING通路蛋白表达。结果与结论:①与对照组比较,模型组细胞活性、超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05),细胞凋亡率、活性氧含量、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平及cGAS、STING、cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05);苦参碱可呈剂量依赖性地改善上述因细胞造模造成的各指标变化(P<0.05),而cGAS过表达可部分拮抗高剂量苦参碱的改善作用。②在动物实验中获得了与体外细胞实验类似的结果。③结果表明,苦参碱可通过阻断cGAS-STING信号传导抑制炎症和氧化应激反应,进而减轻椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡、提升其活性。

中药单体促髓核细胞自噬缓解椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变是临床常见疾病,髓核与髓核细胞是椎间盘中主要的病变组织与细胞类型。髓核细胞受病理因素影响而加速衰老或出现代谢障碍时,髓核稳态被破坏,这导致了椎间盘退变的发生发展。自噬是细胞在病理环境下降解受损细胞器与异常蛋白质以维持正常生理功能的途径之一,能促进细胞自我调节以抵御致病因素影响。椎间盘退变时,髓核细胞处于应力失衡与代谢障碍的异常环境中,促进髓核细胞自噬可清除有害代谢产物累积、延缓细胞老化,这有助于维持髓核与椎间盘的健康生理状态。随着中医药治疗椎间盘退变疾病相关研究的不断深入,大量提取自传统中草药的单体成分被发现可以促进髓核细胞自噬以缓解椎间盘退变。根据最新的研究进展,讨论了髓核细胞的自噬与椎间盘退变的关联,共获取了14种在促进髓核细胞自噬以缓解椎间盘退变领域展现出潜力的中药单体,并将其作用机制归纳为以下4种:促自噬抑制髓核细胞凋亡、促自噬拮抗髓核细胞氧化应激、促自噬抑制髓核细胞外基质降解和促自噬促进髓核细胞外基质大分子合成,以期为中药单体调节髓核细胞自噬从而缓解椎间盘退变的研究提供新的思路与参考。

机械刺激对髓核细胞的作用与椎间盘退变关系的研究进展

椎间盘退变是受多种因素影响的复杂退行性疾病,其机制仍需深入探索。机械刺激对椎间盘内的髓核细胞具有显著影响,对理解退变机制和寻找治疗策略具有重要意义。本文从动物模型、新材料、细胞骨架、细胞通路、线粒体损伤和衰老等方面进行总结,深入挖掘机械刺激对髓核细胞的作用和影响,为腰椎间盘退行性疾病提供更有效、更安全的治疗方案。

椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性

背景:研究表明,miRNA水平与椎间盘细胞的凋亡和增殖、细胞外基质代谢和炎症反应密切相关,而miR-142-3p在椎间盘退变中的具体作用尚不清楚。目的:探讨人腰椎间盘髓核组织中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达与椎间盘退变程度的相关性。方法:选择2020年1月至2022年3月在苏州市第九人民医院因腰椎间盘退行性疾病而行手术的患者82例,术前均行MRI检查,根据Videman分级标准将患者分为轻度退变组(n=36)、中度退变组(n=26)和重度退变组(n=20),获取82份髓核组织标本,检测各组髓核组织中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因表达,以及混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白表达,采用Spearman相关系数法评估miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素β表达与腰椎间盘退变程度的相关性。采用随机数字表法将30只成年SD大鼠分为假手术组(仅穿刺皮肤与肌肉后处死)、轻度退变组(穿刺Co7/8椎间盘1周后处死)与重度退变组(穿刺Co7/8椎间盘2周后处死),每组10只,检测各组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β的蛋白表达,以及miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β的基因表达。结果与结论:①人髓核组织:miRNA-142-3p的表达由高到低的顺序为轻度退变组>中度退变组>重度退变组(P<0.05),混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达由低到高的顺序为:轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P<0.05),Ⅰ型胶原基因与蛋白表达由低到高的顺序为:轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P<0.05),Ⅱ型胶原基因与蛋白表达由高到低的顺序为:轻度退变组>中度退变组>重度退变组的趋势(P<0.05);Spearman相关分析显示,椎间盘退变程度与miRNA-142-3p表达呈负相关(P<0.05),与混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达呈正相关(P<0.05);②大鼠髓核组织:与假手术组比较,轻度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达升高(P<0.05),miRNA-142-3p表达降低(P<0.05);与轻度退变组比较,重度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达升高(P<0.05),miRNA-142-3p表达降低(P<0.05);③结果表明,人腰椎间盘退变程度与髓核组织中miRNA-142-3p表达呈负相关,与混合谱系激酶3和白细胞介素1β表达呈正相关。

XIST对椎间盘退变大鼠髓核细胞增殖及细胞外基质合成的影响及其机制

目的探讨X染色体失活特异转录本(XIST)对椎间盘退变(IDD)大鼠髓核细胞增殖及细胞外基质合成的影响及其机制。方法体外分离培养SD大鼠椎间盘髓核细胞,随机分为对照组、模型组、XIST敲低组、空载质粒组、XIST敲低+miR-132-3p敲低组,除对照组外其余各组细胞以白细胞介素(IL)-1β诱导建立IDD细胞模型。分别处理各组椎间盘髓核细胞后,采用qRT-PCR检测大鼠椎间盘髓核细胞中XIST、miR-132-3p的表达;MTS法和EdU染色检测大鼠椎间盘髓核细胞增殖能力;ELISA测定椎间盘髓核细胞培养液中IL-6、IL-18水平;Western blotting检测大鼠椎间盘髓核细胞细胞外基质标志蛋白Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan)的表达;双荧光素酶报告基因实验检测大鼠椎间盘髓核细胞中XIST对miR-132-3p的靶向调控。采用椎间盘内注射IL-1β诱导建立IDD大鼠模型,分为假手术组、模型组、XIST敲低组、空载质粒组、XIST敲低+miR-132-3p敲低组,每组12只。分别处理各组大鼠后,采用qRT-PCR检测大鼠椎间盘组织中XIST、miR-132-3p的表达;TUNEL染色检测大鼠椎间盘组织髓核细胞凋亡情况;番红O染色观察大鼠椎间盘软骨组织形态;ELISA测定大鼠血清炎性因子IL-6、IL-18水平;Western blotting检测大鼠椎间盘组织中CollagenⅡ、Aggrecan的表达。结果与对照组(细胞)/假手术组(大鼠)相比,模型组大鼠椎间盘髓核细胞及椎间盘组织中XIST表达,椎间盘组织髓核细胞凋亡率,以及椎间盘髓核细胞培养液和血清中IL-6、IL-18水平升高(P<0.05),髓核细胞活力、增殖率,以及髓核细胞和椎间盘组织中miR-132-3p、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,XIST敲低组大鼠椎间盘组织髓核细胞凋亡率,椎间盘髓核细胞培养液和血清中IL-6、IL-18水平,以及髓核细胞和椎间盘组织中XIST的表达降低(P<0.05),髓核细胞活力、增殖率,以及髓核细胞和椎间盘组织中miR-132-3p、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达升高(P<0.05);下调miR-132-3p可减弱敲低XIST对IL-1β诱导的椎间盘损伤和软骨基质流失的改善作用。XIST可靶向下调大鼠髓核细胞中miR-132-3p的表达。结论敲低XIST可能通过上调miR-132-3p而抑制炎症,从而抑制IDD髓核细胞凋亡,促进其增殖及细胞外基质合成。

电针夹脊穴对腰椎间盘退变兔髓核细胞Cav-1和p38 MAPK蛋白表达的影响

目的 通过观察电针夹脊穴对腰椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IDD)兔髓核细胞中小窝蛋白1(caveolin 1,Cav-1)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)蛋白表达的影响,探讨电针延缓IDD髓核细胞衰老的作用机制。方法 采用随机数字表法将25只雄性新西兰大白兔随机分为正常组、假模型组、模型组、模型+电针组及模型+假电针组,每组各5只。造模方式采用加压器对L_4~L_5椎间盘进行200 N压力持续轴向加压28天,通过磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)判断是否造模成功。正常组兔予以自然喂养,不予任何干预;模型组兔使用加压器对L_4~L_5椎间盘加压28天,造模成功后不作任何治疗;假模型组兔同模型组造模方法,保留加压装置及克氏针但不完成椎体加压及干预治疗;模型+电针组兔在模型组的基础上,自造模成功后第1天起予以双侧L_4~L_5夹脊穴电针治疗,电针强度为1~2mA,每次20 min, 1次/天,6天为1疗程,每个疗程间隔1天,共4个疗程;模型+假电针组兔同模型+电针组方法,但在针刺夹脊穴时仅接上电针不接通电流。实验周期结束后,观察各组兔一般情况、MRI下椎间盘信号强度并进行Pfirrmann分级,并采用Western blot法检测椎间盘髓核细胞中Cav-1及p38 MAPK蛋白表达。结果 与正常组兔比较,假模型组兔的一般情况无明显变化,MRI下椎间盘信号差异较小;模型组兔一般情况变差,MRI下椎间盘信号为黑色低信号表现;模型+电针组兔一般情况明显缓解改善,MRI下椎间盘信号增强呈灰-白信号表现,质地更均匀;模型+假电针组兔一般情况较差,无明显改善,MRI下椎间盘呈灰黑色信号,未见明显信号改善。同正常组兔比较,假模型组兔椎间盘Pfirrmann评分、椎间盘髓核细胞Cav-1蛋白表达、p38 MAPK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),模型组兔椎间盘Pfirrmann评分、椎间盘髓核细胞Cav-1蛋白表达、p38 MAPK蛋白表达显著升高(P均<0.05);与模型组、模型+假电针组兔比较,模型+电针组兔椎间盘Pfirrmann评分、椎间盘髓核细胞Cav-1蛋白表达、p38 MAPK蛋白表达明显降低(P均<0.05)。结论 电针可能通过下调椎间盘髓核细胞中Cav-1及p38 MAPK蛋白表达以延缓髓核细胞衰老所致的IDD。

电针夹脊穴对大鼠退变腰椎间盘炎症、髓核细胞周期及FADD/Caspase-8信号通路的影响

【目的】观察电针夹脊穴对腰椎间盘退变大鼠的治疗作用及机制。【方法】将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组与电针组,每组10只。模型组与电针组大鼠采用纤维环穿刺法构建腰椎间盘退变模型,假手术组仅分离椎间盘,不做其他处理。造模成功后,电针组于L4、L5双侧夹脊穴电针治疗,假手术组与模型组不给予处理。干预结束后,采用电子Von Frey测痛仪检测机械缩足阈值(PMWT),苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠腰椎间盘结构变化,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测腰椎间盘组织上清液白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,流式细胞仪检测髓核细胞周期比例,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测腰椎间盘髓核组织Fas相关死亡域蛋白(FADD)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(Caspase-8)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2 mRNA表达水平,Western Blot法检测椎间盘髓核组织FADD、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白表达水平。【结果】模型组大鼠腰椎间盘整体结构异常,可见到明显退变;电针组大鼠腰椎间盘组织退变程度较模型组明显改善。与假手术组比较,模型组大鼠PWMT降低,IL-1β、TNF-α水平升高,髓核细胞G0/G1期比例升高,G2/M期细胞比例降低,FADD、Caspase-8、Bax mRNA及蛋白表达水平升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组大鼠PWMT升高,IL-1β、TNF-α水平降低,髓核细胞G0/G1期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高,FADD、Caspase-8、Bax mRNA及蛋白表达水平降低,Bcl-2 mRNA及蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。【结论】电针夹脊穴可通过调控FADD/Caspase-8信号通路抑制细胞凋亡来缓解炎症反应、调控髓核细胞周期,改善腰椎间盘结构变化,从而延缓大鼠腰椎间盘退变。

髓核细胞退变模型建立的研究进展

髓核细胞(NPCs)退变模型对研究椎间盘退变(IVDD)病理机制和治疗策略有着重要意义。对于退变严重的NPCs,往往较难贴壁生长,而轻度退变的细胞,虽可体外培养,但难有显著的实验结果,因此通过不同的诱导手段构建有效的退变细胞模型,不仅可以提升实验的可信度,更能增加实验数据的说服力。目前有较多诱导NPCs退变的方法,但模型建立缺乏统一标准,且无系统性的总结。因此,本文将从诱导NPCs退变的方式、方法、模型效果评价指标等方面展开综述,并从物理、化学和生物工程等方面对不同建模方式进行了分类总结,旨在为筛选、评价有效的退变细胞模型建立方法,探究IVDD治疗机制等研究提供参考。

锌指蛋白A20及其相关炎症因子在椎间盘髓核细胞退变前后的表达变化

目的检测椎间盘髓核细胞退变前后锌指蛋白A20及其相关炎症因子的表达变化。方法获取我院骨科患者术中切除的椎间盘组织,分为正常组和退变组,采用阿辛蓝染色观察人椎间盘髓核细胞的退变情况,免疫组化观察人椎间盘髓核细胞A20、TNF-α、IL-1β及NF-κB p65蛋白的表达。体外培养胚胎小鼠髓核细胞,分为对照组(只加入等量的PBS)、内毒素(LPS)刺激组和NF-κB抑制组,分别以Real-time PCR检测LPS刺激细胞和加入NF-κB抑制剂后,A20、TNF-α、IL-1β、I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(ADAMST-4)、Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5(ADAMST-5)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达变化;Western blot检测A20、TNF-α、IL-1β、ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-13、p65、磷酸化p65(p-p65)的表达变化。结果退变组髓核细胞数量显著少于正常组,并有明显的聚集现象;退变组髓核细胞中A20、TNF-α、IL-1β、p65蛋白表达明显高于正常组;LPS刺激胚胎小鼠髓核细胞后,LPS刺激组A20、TNF-α、IL-1β、ADAMST-4、ADAMST-5、MMP-13mRNA与蛋白的表达均高于NF-κB抑制组与对照组(P<0.05),A20、TNF-α、IL-1β、ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-13、p65、p-p65蛋白含量也较NF-κB抑制组与对照组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论髓核细胞炎症反应与椎间盘退变的发生、发展密切相关,A20可能通过NF-κB信号通路对抑制髓核细胞退变时炎症反应起到关键作用。

单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘髓核细胞的形态学观察

目的:探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外培养扩增人退变椎间盘髓核细胞的可行性。方法:收集20例人退变椎间盘髓核,单纯Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,观察髓核细胞的类软骨表型表达情况。结果:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可较好的分离培养人退变椎间盘髓核细胞,20例人退变椎间盘髓核,培养成功16例;原代髓核细胞平均7d贴壁,呈类圆形或多角形,P1代髓核细胞平均12h贴壁,呈大梭形或多角形,两代细胞融合95%所需时间分别为30d和7d,差异有统计学意义(P<0.01);聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原主要表达于原代和P1代髓核细胞浆内,被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞化学染色主要表现为黄褐色沉淀,两代间聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达无统计学差异(P>0.05)。结论:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可简化髓核细胞分离步骤,提高培养效率;传一代后髓核细胞增殖速率提高,但仍维持类软骨表型,表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。

沉默信息调节因子2同源蛋白1通过Akt/PKB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1/sirtuin 1)是组蛋白去乙酰化酶,参与表观遗传修饰调节,促进多种细胞的生存,但目前对椎间盘髓核细胞的作用未见研究.为了阐明临床不同来源的椎间盘髓核手术标本SIRT1的表达变化,用免疫组化、定量RT-PCR、Western blot方法对中老年腰椎间盘突出症病人及青壮年腰椎骨折病人术中髓核标本进行研究,表明老年人髓核SIRT1的mRNA及蛋白质水平均显著低于青壮年的髓核.同时,用resveratrol(SIRT1激动剂)、烟碱(SIRT1抑制剂)、SIRT1-siRNA对培养的退变髓核细胞进行处理或转染后,用流式细胞仪检测凋亡率变化,结果表明resveratrol能显著促进退变髓核细胞生存,相反,当烟碱或SIRT1-siRNA转染后则显著促进髓核细胞凋亡.为了进一步分析SIRT1抑制退变髓核细胞凋亡的分子机制,应用Western blot及抑制剂方法研究表明,当SIRT1-siRNA转染髓核细胞后能降低磷酸化Akt蛋白的表达,而白藜芦醇处理则促进磷酸化Akt蛋白的表达,当用LY294002(PI3K抑制剂)或Akt-siRNA转染后显著抑制髓核细胞的生存率.研究结果表明,SIRT1通过Akt通路能显著抑制髓核细胞凋亡,为深入揭示退变性椎间盘疾病的病理生理及生物治疗提供新的思路和靶点.

益气活血方对非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞ColⅡ、Aggrecan及TIMP-1 mRNA的影响

目的探讨益气活血方对人体非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞中Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)及金属基质蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)mRNA的表达的影响。方法选择非破裂型腰椎间盘突出症(LDH)的住院患者经手术摘除的腰椎间盘组织,采用组织块法培养原代细胞;以SPF级雄性SD大鼠制备药物血清。将传代第1代的退变髓核细胞分为3组,实验组分别予体积比为5%、10%的益气活血方血清DMEM培养液;对照组加入生理盐水血清DMEM培养液。通过Realtime PCR检测ColⅡ、Aggrecan、TIMP-1mRNA的表达。结果与生理盐水组比较,益气活血方血清可上调非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞中ColⅡ、Aggrecan mRNA的表达(P<0.05),未检测出TIMP-1mRNA的变化。结论益气活血方可能通过影响非破裂型腰椎间盘突出髓核细胞中ColⅡ、Aggrecan含量,进而发挥防治非破裂型腰椎间盘突出髓核细胞的退变作用。

Toll样受体4及白细胞介素-23、白细胞介素-17A在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其临床意义

目的探讨Toll样受体4(TLR4)及白细胞介素-23(IL-23)、IL-17A在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其临床意义。方法选取2019年2月—2022年2月青海大学附属医院收治的97例腰椎间盘突出症(LDH)患者作为研究组。另选取同期该院行前路减压内固定切除的脊柱骨折患者58例作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测两组腰椎间盘髓核组织TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量。比较研究组不同腰椎间盘退变等级患者TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量,分析研究组TLR4与IL-23、IL-17A mRNA相对表达量的相关性。结果研究组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。V级组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组(P<0.05),Ⅳ级组高于Ⅱ级组、Ⅲ级组(P<0.05),Ⅲ级组高于Ⅱ级组(P<0.05)。重度腰痛组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于中度腰痛组(P<0.05)。重度腰椎功能丧失组TLR4、IL-23、IL-17A mRNA相对表达量高于中度腰椎功能丧失组(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,研究组退变腰椎间盘髓核组织TLR4 mRNA相对表达量与IL-23 mRNA、IL-17A mRNA相对表达量呈正相关(r=0.662和0.671,均P<0.05)。结论LDH患者退变腰椎间盘髓核组织TLR4、IL-23、IL-17A异常高表达,且与LDH患者腰椎间盘退变等级、病情严重程度关系密切。

髓核细胞与骨髓基质细胞移植对受损椎间盘退变的影响

目的探讨移植兔骨髓基质细胞(MSC)和髓核细胞(NPC)对受损椎间盘退变的影响及影像学特点。方法采用原代细胞培养法获取并扩增NPC及MSC。2岁龄新西兰白兔随机分为3组:盐水注射组3只,MSC移植组6只,NPC移植组6只,L3/4、L4/5、L5/6椎间盘进行髓核穿刺抽吸后,分组注入盐水、MSC和NPC。未处理的L2/3、L6/7、L7/S1椎间盘作为对照组采集数据。术前及术后4、6、8周,相同条件下摄取腰椎侧位X光片,运用I mage-pro plus6.0测量椎间盘高度指数(DHI)计算%DHI;Merge eFil m Workstation测量MRI T2像椎间盘信号强度并进行标准化(ST2WI),计算%ST2WI。结果两细胞移植组较之盐水组均能够有效的抑制损伤椎间盘进行性的高度丢失、骨性终板破坏、骨赘形成、细胞外基质丧失等。NPC组第6周%DHI为(74.31±2.59)%,第8周为(79.29±2.53)%,两者间差异有统计学意义(P<0.05),提示8周时NPC组椎间盘高度恢复;且第8周时NPC组与MSC组的%DHI之差异无统计学意义。%ST2WI数据显示第8周时NPC组T2信号强度高于MSC组〔(70.63±7.60)%vs(54.32±7.92)%,P<0.05〕,提示NPC组细胞外基质的合成可能超过MSC组。结论NP及MSC两种细胞移植能够有效避免椎间盘损伤后发生的进行性的退变过程。8周后NPC组较MSC组显示出更强的基质合成能力,椎间盘高度及含水量出现恢复的迹象。提示外源性NPC能够良好的适应受体椎间盘环境,并发挥相应的细胞外基质分泌功能。

退变腰椎间盘髓核细胞立体培养与单层培养的生物活性比较

目的:比较体外单层培养和旋转微载体立体培养人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学活性指标,探讨更加有效的椎间盘髓核细胞体外培养方法。方法:对获取的腰椎间盘突出症患者的24个椎间盘按年龄分为A组(20～25岁)、B组(26～30岁)、C组(36～45岁)及D组(>45岁),分别利用酶消化法进行单层细胞培养和旋转微载体立体培养系统进行立体培养,观察细胞生长形态,检测细胞生长曲线及速度、细胞生长活性、细胞分裂指数及胶原含量。结果:单层培养的髓核细胞贴壁后为多角形或梭形,伸出伪足;立体培养的细胞在微载体上呈梭形或不规则形,呈立体状生长。立体培养的细胞生长速度较快,1周内两种培养方法各时间点及各组间比较均具有统计学意义(P<0.05)。立体培养的髓核细胞活性提高,随年龄增加细胞活性下降;指数生长期细胞分裂指数与单层培养相比有统计学意义(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ型胶原含量与单层培养相比有统计学意义(P<0.05),A组分别与B组、C组及D组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:旋转立体培养人退变椎间盘髓核细胞的活性保持良好,较单层培养能够大量、优质收集种子细胞,可用于椎间盘组织工程中种子细胞的研究。

成人退变性椎间盘髓核细胞体外培养及形态学观察

目的通过对成人退变椎间盘髓核细胞的体外培养和形态学观察,进一步研究细胞因素在椎间盘退变中的作用机制。方法取5例患椎间盘突出症并行椎间盘摘除手术的成人髓核,分离后在培养基中进行髓核细胞培养,细胞染色、逆转录聚合酶链式反应、免疫荧光检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。结果椎间盘髓核细胞可在体外培养,30d后方可进行传代,最佳的培养条件为胎牛血清/培养基体积分数为10%～20%,pH值7.0。髓核细胞中出现Ⅰ型胶原,并具有较高的表达,Ⅱ型胶原表达微弱。结论成人退变髓核细胞体外培养时间较长,细胞增殖能力低下,特定培养条件的摸索是成功与否的关键。

髓核细胞移植抑制椎间盘退变

背景:近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。目的:探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。方法:通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。结果与结论:通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。