二甲双胍通过Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的探讨二甲双胍通过蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)3β/β-连环蛋白(β-Catenin)信号通路对白细胞介素(IL)-1β诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡的影响。方法体外培养人椎间盘髓核细胞,并分为IL-1β组、IL-1β+低浓度二甲双胍(40μg/ml)组、IL-1β+中浓度二甲双胍(80μg/ml)组、IL-1β+高浓度二甲双胍(160μg/ml)组、IL-1β+高浓度二甲双胍+MK2206(Akt/GSK3β/β-Catenin通路抑制剂,10μmol/L)组,另正常培养人椎间盘髓核细胞作为Control组。MTT法检测各组细胞活性;hochest 33258法检测各组细胞凋亡;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;GFP-LC3法检测各组细胞自噬水平;Western印迹检测各组细胞Akt/GSK3β/β-Catenin通路相关蛋白、凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax、Bcl-2)、自噬相关蛋白(LC3B、Atg7、Beclin1、p62)及椎间盘退变相关蛋白(aggrecan、collagenⅡ)表达水平。结果与Control组比较,IL-1β诱导后人椎间盘髓核细胞活性显著降低(P<0.05),大部分细胞核被染成亮蓝色,凋亡率和自噬体数明显增加(P<0.05),促凋亡蛋白(caspase-3、Bax)、自噬促进蛋白(LC3B、Atg7、Beclin1)、β-Catenin蛋白表达水平及炎症因子(IL-6、TNF-α)表达量明显升高(P<0.05),抗凋亡蛋白(Bcl-2)、自噬抑制蛋白(p62)和aggrecan、collagenⅡ蛋白表达水平及Akt、GSK3β磷酸化水平明显降低(P<0.05)。低、中、高浓度二甲双胍的加入使上述各项指标与模型组呈相反趋势,且表现为浓度依赖性(P<0.05)。而MK2206刺激后,Akt、GSK3β磷酸化水平降低(P<0.05),β-Catenin蛋白表达水平升高(P<0.05),并逆转二甲双胍对IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞的保护作用(P<0.05)。结论二甲双胍通过激活Akt/GSK3β/β-Catenin信号通路促进IL-1β诱导的人椎间盘髓核细胞增殖,并抑制其凋亡、炎症反应及自噬,进而减缓椎间盘退变进程。

miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的细胞活性及凋亡的影响

目的:研究miR-663b对低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞增殖凋亡的调控机制。方法:运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测人椎间盘退缩患者组织和葡萄糖(5、1 mmoL/L)处理的椎间盘退变髓核细胞中miR-663b的表达;脂质体法将低糖组+miR-NC组(转染miR-NC)、低糖组+miR-663b组(转染miR-663b mimics)、低糖组+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、低糖组+anti-miR-663b组(转染anti-miR-663b)转染至1 mmoL/L处理的椎间盘退变髓核细胞。细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术、免疫印迹(Western blot)检测细胞的吸光度(OD)值、细胞的凋亡率、细胞中细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)的蛋白表达。结果:miR-663b在人椎间盘退缩患者组织和1 mmoL/L葡萄糖(低糖组)处理的椎间盘退变髓核细胞中的表达均明显降低(P<0.05)。低糖组细胞的增殖能力受到抑制,凋亡能力得到提升,并且P21和Caspase-3的蛋白表达量得到提升。过表达miR-663b的低糖组细胞中miR-663b表达明显升高,细胞增殖能力也明显升高,细胞凋亡能力则明显降低,P21和Caspase-3的蛋白表达量得到抑制,而抑制miR-663b的低糖组细胞则发生相反的作用。结论:miR-663b可促进低糖诱导的人椎间盘退变髓核细胞的增殖,抑制凋亡。