去甲肾上腺素对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响

目的观察去甲肾上腺素(NE)对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响。方法体外培养HepG2细胞和L-02细胞,分别加入不同浓度NE处理,继续培养,采用MTT法观察细胞增殖情况,HE染色和Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞形态学变化,流式细胞术观察细胞凋亡情况。结果经0.1、1、10、50μmol/L NE处理24、48 h,HepG2细胞OD值显著下降(P均<0.05),L-02细胞OD值无明显变化。10μmol/L NE作用于HepG2细胞可见典型的凋亡形态学改变,胞质收缩、深染,核染色质浓缩;L-02细胞在NE作用前后形态学均无明显改变。HepG2细胞加入10μmol/L NE后部分细胞呈绿色(为早期凋亡表现),加入50μmol/L NE后部分细胞膜呈绿色,细胞核呈红色(为晚期凋亡表现);L-02细胞均未显示有荧光。0.1、1、10μmol/L NE作用于HepG2细胞24 h后,其凋亡率均显著高于对照组(0μmol/L NE),且呈剂量依赖关系(P均<0.05);而上述浓度NE作用于L-02细胞24 h后,其凋亡率较对照组先增高后降低(P均<0.05)。结论 NE可以抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,而对L-02细胞增殖和凋亡没有影响,提示其在特定类型肝癌临床治疗中具有潜在价值。

雷公藤甲素对人肝细胞L-02氧化损伤的初步研究

目的研究雷公藤甲素对正常人肝细胞株L-02细胞凋亡和活性氧生成的影响。方法体外培养L-02细胞,MTT法检测雷公藤甲素对L-02细胞的毒性作用,H2DCFH-DA探针流式细胞仪检测细胞中ROS生成量,并测定细胞SOD活性、MDA含量及LDH释放量的变化。结果雷公藤甲素诱导L-02细胞中ROS生成,且随时间的延长而增多,至12h时达峰值(P<0.01);同时,雷公藤甲素也能诱导细胞中MDA含量及LDH释放量的增加,诱导SOD活性的降低。结论雷公藤甲素体外诱导人正常肝细胞L-02细胞凋亡可能与其促进活性氧生成有关。

丝裂霉素C聚氰基丙烯酸正丁酯磁性纳米球对肝细胞L-02的生长抑制作用

目的 研究丝裂霉素C聚氰基丙烯酸正丁酯磁性纳米球 (MMC PBCA MNPS)、PBCA MNPS和MF(磁流体 )以及MMC对正常人肝细胞株 (L 0 2细胞 )生长抑制作用的影响。方法 用乳化聚合法分别制备了PBCA MNPS与MMC PBCA MNPS;采用MTT比色法研究了不同浓度的MMC PBCA MNPS、PBCA MNPS、MF与MMC对L 0 2细胞生长抑制作用的影响 ;用自动生化仪测定了乳酸脱氢酶 (LDH)活性。结果收稿日期 :2 0 0 4-0 2 -0 3 ,修回日期 :2 0 0 4-0 3 -19基金项目 :国家“863”资助项目 ( 2 0 0 2AA2 14 12 1) ;广东省攻关资助项目 ( 2 0 0 2C3 0 10 3 )作者简介 :任 非 ( 1974-) ,女 ,博士 ,研究方向 :生物药剂学 ,Tel:0 2 0 6164 1888 872 3 6,E mail:renfeisky @tom .com ;陈建海 ( 1947-) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :生物高分子材料 ,生物药剂学不同浓度的MMC PBCA MNPS对L 0 2细胞的相对抑制率(RIR % )为 :10 0 %、15 1%、2 5 1%、32 1%、39 9%与 4 5 0 % ;不同浓度的PBCA MNPS的RIR %依次为 :1 8%、5 2 %、10 0 %、12 9%、15 1%与 2 9 9% ;不同MMC浓度的RIR %依次为 :2 2 1%、35 1%、4 6 1%、6 2 0 %、80 1%与 88 9%。MF不仅不抑制L 0 2细胞的生长 ,还有利于细胞的生长。按照相对生长率 (RGR % ) ,MMC PBCA

TPT1表达载体的构建及在肝细胞系L-02中的表达

目的构建肝细胞癌高表达基因TPT1真核表达载体,并转导肝细胞系L-02,为进一步研究其在肝细胞癌发生、发展过程中的作用奠定基础。方法通过PCR方法在TPT1 ORF两侧添加EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列而将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,构成pEGFP-N3TPT1重构体,卡那霉素筛选阳性克隆,碱裂解法抽提质粒,Sanger法测序,VecScreen和BLAST分析测序结果,lipofectAM INE转导肝细胞系L-02,荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达情况。结果将TPT1成功插入pEGFP-N3中,转导L-02后,在荧光显微镜下,可见明亮的绿色荧光。pEGFP-N3TPT1转导的细胞,TPT1 mRNA水平较对照高1.59倍(P<0.05)。结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,pEGFP-N3TPT1可在L-02细胞内高效表达。

L-选择素在肝癌细胞株HepG2中的表达

目的:观察L-选择素在人正常肝细胞株(L-02)和人肝癌细胞株(HepG2)中的表达。方法:应用RT-PCR法检测肝癌细胞株HepG2、正常肝细胞株L-02中L-选择素mRNA表达情况;应用流式细胞术检测HepG2细胞、L-02细胞中L-选择素的蛋白表达。结果:L-选择素mRNA在HepG2细胞中有表达,而在正常肝细胞株L-02细胞中无表达;HepG2细胞L-选择素的表达量为(10.09±0.51)%,而在L-02细胞中则无表达。结论:L-选择素在HepG2细胞中有表达而在L-02细胞中不表达。

丹参、黄芪及野菊花注射液对正常人肝细胞增殖的影响

目的:比较不同中药注射剂对正常人肝细胞株L02增殖的影响。方法:将丹参、黄芪、野菊花注射液,采用不同浓度直接加入培养液的给药方式,以MTT法测定三种注射液对正常人肝细胞株L02的增殖情况。结果:丹参注射剂对人肝细胞株增殖有明显的促进作用,且随用药剂量的增大,呈一定的量效关系;黄芪、野菊花注射液对L02细胞株增殖作用不明显。结论:丹参注射液对人肝细胞株L02增殖具有促进作用,同时提示不同的中药注射液各有其特点,中医临床辨证论治应存在不同的机理。

油酸诱导培养肝细胞脂肪变性模型的建立

目的以人正常肝细胞株L-02为实验材料,采用油酸诱导建立培养肝细胞脂肪变性模型。方法将人肝细胞株L-02进行细胞培养,加入不同浓度的油酸,采用MTT法确定油酸诱导肝细胞脂肪变的最佳浓度,以油红O染色观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞内TG的含量及上清中的ALT、AST的水平。结果用含20μg/ml油酸的1640培养基培养L-02肝细胞72h,光镜及电镜下见肝细胞内有典型的脂滴形成,肝细胞内TG含量显著升高;ALT及AST较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功建立了油酸诱导培养肝细胞脂肪变性的模型。

当归多糖对肝细胞Hepcidin表达的影响

目的探讨当归多糖(ASP)对人肝癌细胞Hep G2和人正常肝细胞L-02 Hepcidin表达的抑制作用。方法体外培养Hep G2和L-02细胞,RT-PCR检测不同浓度(0、100、200、400 mg/L)的ASP诱导不同时间(0、24、48、72 h和96 h)对两种细胞Hepcidin mRNA影响。Western印迹观察400 mg/L ASP诱导96 h对两种细胞Hepcidin表达的抑制作用。结果与对照组(0 mg/L)相比,浓度高于200 mg/L ASP能够显著下调Hep G2和L-02细胞Hepcidin mRNA表达(P<0. 001); 400 mg/L ASP连续作用48 h后对Hep G2和L-02细胞产生显著的Hepcidin抑制效应且抑制强度呈时间相关性; 400 mg/L ASP连续作用96 h后显著抑制Hep G2和L-02细胞Hepcidin表达(P<0. 001)。结论 ASP可以抑制Hep G2和L-02细胞中Hepcidin的表达。

山豆根主要成分苦参碱诱导人正常肝细胞L-02凋亡及其对细胞周期的影响

目的:探索山豆根主要成分苦参碱诱导人肝(实质)细胞L-02凋亡的作用及其对细胞周期的影响。方法:以人肝细胞株L-02为模型,应用CCK8法以及流式细胞仪检测山豆根提取物(water extracts of sophorae tonkinensis radix et rhizoma,WE-SRR)及苦参碱(matrine,MT)在不同时间与浓度对L-02细胞增殖的影响以及作用15 h后对L-02凋亡及细胞周期的影响。结果:WE-SRR及MT均能时间及剂量依赖性抑制L-02细胞增殖。12和18 mg·m L-1WE-SRR及1. 67和2 mg·m L-1MT可诱导早期凋亡,而20 mg·m L-1WESRR组则表现为诱导晚期凋亡。所有浓度WE-SRR均可引起G2/M期细胞比例升高,且18和20 mg·m L-1WE-SRR组S期细胞比例升高; MT组低浓度时G0/G1期细胞比例明显升高,高浓度(2 mg·m L-1)时G2/M期细胞、S期细胞比例均明显升高。结论:WE-SRR及MT对人正常肝细胞L-02具有细胞毒性,其机制包括抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞。MT和WE-SRR对细胞的影响变化趋势一致,推测MT是WE-SRR的主要毒性物质成分之一。

纳米锰锌铁氧体对肝细胞L-02的细胞毒性

目的研究纳米锰锌铁氧体对正常人肝细胞株(L-02)的体外毒性。方法使用透射电镜(TEM)以及X射线衍射仪(XRD)对纳米锰锌铁氧体进行表征,采用噻唑蓝实验(MTT比色法)检测M0.5Zn0.5Fe2O4纳米材料不同浓度(6.25、25、50、100、200、400和800μg/ml)以及不同染毒时间24、48和72 h对L-02细胞活性的影响,观察染毒48 h后细胞形态的改变并检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。结果纳米Mn0.5Zn0.5Fe2O4为粒径大约15 nm左右的圆形或椭圆形尖晶石型锰锌铁氧体。L-02细胞的生长活性随着Mn0.5 Zn0.5 Fe2O4浓度的升高和染毒时间的延长而下降。各剂量组细胞活力在染毒48 h后趋于平稳,当纳米颗粒浓度达到200μg/ml时,细胞的存活率明显低于对照组(P<0.01)。与对照组相比,当浓度达到100μg/ml时,染毒48 h的L-02细胞形态发生改变,培养液上清中LDH活性明显升高(P<0.05)。结论随着浓度的增加和时间的延长纳米锰锌铁氧体对L-02细胞毒性增加,破坏细胞膜完整性可能是锰锌铁氧体纳米颗粒造成细胞损伤的途径之一。

雷公藤甲素诱导肝细胞L-02凋亡的机制

目的:探讨雷公藤甲素对人正常肝细胞L-02细胞的凋亡诱导作用及细胞线粒体呼吸链复合体抑制剂对细胞凋亡的影响。方法:采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测雷公藤甲素对L-02细胞的凋亡作用,JC-1染色观察细胞线粒体膜电位的变化,线粒体呼吸链复合体抑制剂对细胞活性氧释放及细胞凋亡的影响。结果:流式细胞仪检测结果显示,雷公藤甲素对细胞增殖的抑制作用与浓度、时间呈正相关;JC-1染色可见经雷公藤甲素作用的细胞线粒体膜电位降低;加入细胞线粒体呼吸链抑制剂后,与单用雷公藤甲素组比较,雷公藤甲素+rotenone组细胞活性氧释放水平显著降低(P<0.05),同时抑制剂合用组细胞凋亡百分率显著降低(P<0.05)。结论:雷公藤甲素体外可诱导L-02细胞凋亡,机制可能是与公藤甲素上调经线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ产生的活性氧有关。

雷公藤甲素对人肝细胞L-02肝药酶活性的影响

目的:研究雷公藤甲素对正常人肝细胞株L-02细胞的损伤作用及其对肝CYP3A及CYP2E1蛋白表达量的影响。方法:体外培养L-02细胞,MTT法检测雷公藤甲素对L-02细胞的损伤,试剂盒测定培养基上清液中AST、ALT及AKP活性,Western-blot测定细胞中CYP3A及CYP2E1蛋白的含量。结果:雷公藤甲素对L-02细胞有损伤作用,且随雷公藤甲素浓度的增加或孵育时间的延长,其损伤作用增强,同时,培养基中AST、ALT及AKP的活性增强;雷公藤甲素诱导细胞中CYP3A蛋白表达减弱,CYP2E1蛋白表达增强。结论:雷公藤甲素体外对人正常肝细胞L-02细胞有损伤作用,且能影响肝CYP450酶系的表达。

雷公藤甲素对人肝细胞L-02钙离子及P38MAPK磷酸化的影响

目的:研究雷公藤甲素对正常人肝细胞株L-02细胞凋亡诱导的作用及对细胞内钙离子及p38MAPK磷酸化的影响。方法:体外培养L-02细胞,Fluo-3AM标记与PI法观察雷公藤甲素对细胞的损伤作用,并测定雷公藤甲素作用下L-02细胞内钙离子浓度及Phospho-p38与Total-p38的含量。结果:雷公藤甲素体外诱导L-02细胞损伤,随着孵育时间的延长,细胞内钙离子浓度升高,至9h时达峰值(P<0.01),12h时有所下降(P<0.05);同时,雷公藤甲素促进细胞中P38MAPK的磷酸化(P<0.01),但对Total-p38无影响。结论:细胞内钙离子的释放及p38MAPK的磷酸化可能参与了雷公藤甲素引起的L-02细胞毒性。

雷公藤甲素对Caspase诱导人肝细胞L-02凋亡机制的研究

目的:研究雷公藤甲素诱导正常人肝细胞株L-02细胞凋亡的机制。方法:体外培养L-02细胞。MTT法检测雷公藤甲素的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双染法检测雷公藤甲素对L-02细胞的凋亡诱导作用;测定细胞基质中半胱天冬氨酸酶(Caspase)8、Caspase9与Caspase3活性的变化及加入Caspase抑制剂Z-DEVD-FMK后对细胞凋亡的影响。结果:雷公藤甲素能显著诱导L-02细胞的凋亡,其作用呈明显的量效关系与时间依赖性;120nmol·L-1雷公藤甲素作用L-02细胞24h使Caspase3的活性显著增强;加入Z-DEVD-FMK后,能有效抑制雷公藤甲素诱导的细胞凋亡。结论:雷公藤甲素体外诱导正常人肝细胞株L-02细胞凋亡可能与上调Caspase3、9的活性有关。

黄芩素激活核转录因子Nrf2拮抗肝毒性的研究

目的研究黄芩素(Baicalein,BAI)对核转录因子Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)的转录激活,以及对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)、乙醇(ethanol)和对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导的人正常肝L-02细胞毒性的拮抗作用。方法在肝L-02细胞中,采用瞬时转染报告基因实验检测不同浓度黄芩素对Nrf2转录激活的影响。在L-02细胞上分别用APAP(10 mmol·L-1)、CCl4(10 mmol·L-1)、Ethanol(100 mmol·L-1)诱导肝细胞毒性。黄芩素1、10、25、50、100μmol·L-1分别与细胞预孵15 min后,加入上述肝毒性物质,48 h后采用MTT法检测细胞存活率。结果与对照组比较,黄芩素(25、50μmol·L-1)能明显提高Nrf2的转录激活(P<0.01,P<0.05)。与对照组比较,3种肝毒性物质均能明显降低细胞存活率(P<0.01),而黄芩素能剂量依赖性地提高给予APAP、CCl4和Ethanol后降低的L-02细胞存活率(P<0.01)。结论黄芩素可以诱导重要的抗氧化核转录因子Nrf2的转录激活,这可能是黄芩素拮抗外源性肝毒性物质APAP、CCl4和Ethanol诱导的L-02肝细胞毒性的机制之一。

马尾松树皮提取物对四氯化碳损伤肝细胞的保护作用

目的体外探讨马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extract,PMBE)对四氯化碳(CCl4)损伤人正常肝细胞(L-02)的保护作用及其对血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达的影响。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,细胞形态观察、荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,对细胞内丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、培养上清液中谷草转氨酶(AST)和丙谷转氨酶(ALT)水平分别进行检测,酶联免疫吸附法(ELISA)、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)及Western免疫印迹法检测细胞内HO-1活性、HO-1 m RNA及蛋白表达情况。结果与CCl4损伤组比较,PMBE预处理组细胞存活率、GSH含量和相关抗氧化酶类水平升高,细胞凋亡和坏死比率、MDA含量及上清液中AST和ALT活性降低,HO-1活性、HO-1 m RNA和蛋白表达水平均上调,但与CCl4损伤组无明显差异。结论 PMBE对CCl4损伤L-02细胞有保护作用,其机制可能与HO-1的表达密切相关。

HERG K^+通道对VEGF诱导的肝癌细胞迁移和侵袭的影响

目的研究HERG K+通道对VEGF诱导的肝癌细胞在侵袭和迁移方面的调节作用。方法运用膜片钳技术分别检测正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系SMMC-7721中HERG K+通道的表达情况;采用Bodyen-Chamber系统检测在HERG K+通道特异性抑制剂E-4031作用后,对VEGF诱导的SMMC-7721细胞侵袭力和迁移潜能方面的影响;ELISA法检测E-4031处理SMMC-7721细胞后,培养基上清中的VEGF水平的变化。结果 HERG K+通道在SMMC-7721细胞中表达,而在L-02细胞中不表达;且VEGP诱导的SMMC-7721细胞侵袭和迁移现象可被E-4031呈剂量依赖性地抑制;在阻断HERG K+通道后上清中VEGF水平明显降低。结论肝癌细胞中存在HERG K+通道,它可通过调控VEGF分泌水平来影响肝癌细胞的侵袭和迁移能力。由此,HERG K+通道将有可能成为诊断肝癌和判断预后的新标志物及治疗的新靶位。