清肺通络方调控Caspase-1对肺炎支原体诱导人正常肺上皮细胞BEAS-2B焦亡的干预作用

【目的】探讨清肺通络方(桑白皮、地骨皮等)对肺炎支原体(MP)诱导人正常肺上皮细胞BEAS-2B由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路介导的细胞焦亡的干预作用。【方法】建立MP感染的BEAS-2B细胞模型,分别给予清肺通络方、Caspase-1抑制剂干预。制备过表达Caspase-1质粒,转染MP感染的BEAS-2B细胞,给予清肺通络方干预。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖活性,Western Blot法检测细胞焦亡关键蛋白pro-Caspase-1、Caspase-1、消皮素D(GSDMD)、消皮素D-N端片段(GSDMD-N)的表达水平,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平,生化法检测乳酸脱氢酶(LDH)和Na+-K+-ATP酶活性,流式细胞术检测细胞焦亡。【结果】MP感染BEAS-2B细胞增殖活性明显降低,细胞焦亡关键蛋白pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表达水平均明显升高,下游细胞因子IL-1β和IL-18水平也显著升高,LDH活性明显升高,Na+-K+-ATP酶活性明显下降,细胞焦亡率显著上升。应用清肺通络方、Caspase-1抑制剂干预MP感染BEAS-2B细胞,及应用清肺通络方干预过表达Caspase-1质粒转染的MP感染BEAS-2B细胞后,细胞增殖活性均升高,细胞焦亡关键蛋白pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表达水平降低,下游细胞因子IL-1β和IL-18水平均显著降低,LDH活性明显降低、Na+-K+-ATP酶活性明显上升,细胞焦亡率明显下降。【结论】MP感染BEAS-2B细胞后,激活Caspase-1/GSDMD通路,促进炎症因子释放,使细胞结构受损,最终导致细胞焦亡。清肺通络方可以抑制Caspase-1/GSDMD通路的激活,减轻炎症反应,减轻细胞损伤,抑制细胞焦亡。

基于转录组测序探究PM2.5损伤肺上皮细胞BEAS-2B的相关机制

目的研究PM2.5对肺上皮细胞BEAS-2B基因表达的影响,并探讨其可能作用的信号通路。方法BEAS-2B细胞分为对照组(PBS处理)和PM2.5组(200 mg/L PM2.5处理),干预24 h后提取各组细胞总RNA进行高通量测序。所得的序列经质控,与参考基因组比对,获得用于后续转录本组装、表达量计算的mapped data(reads)后,比对到6大数据库[NR、Swiss-Prot、Pfam、COG(Evolutionary genealogy of genes)、GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)]注释,利用差异分析软件DESeq2筛选出差异表达基因(DEGs),运用生物信息学分析方法对DEGs进行GO和KEGG生物功能等分析,采用qRT-PCR法检测5个关键基因(FOSB、FOSL1、MUC5AC、CSF2、IL-6)进行验证。结果PM2.5组和对照组与转录组的数据比较后共获得961个DEGs,其中PM2.5组上调表达453个,下调表达508个。通过GO和KEGG功能分析后发现这些DEGs主要参与了细胞蛋白质的磷酸化、免疫调节过程、信号转导途径的调节以及凋亡途径的调控过程,并显著富集于IL-17信号通路。qRT-PCR结果显示,PM2.5组FOSB、FOSL1与IL-6的相对表达量显著上调(P<0.05),这与RNA-seq测序结果一致。结论PM2.5可能通过调控"IL-17信号通路"中关键基因的表达,加重了细胞的炎症反应,促进了细胞凋亡等生命进程。

NOX4在BEAS-2B细胞上皮间质转化过程中的作用

目的:探索非吞噬细胞氧化酶4(NOX4)在人肺正常上皮细胞BEAS-2B上皮间质转化过程中的作用。方法:选取对数生长期的BEAS-2B细胞,分为空白对照组、NOX4抑制剂二苯基氯化碘(DPI)组、TGF-β组和TGF-β+DPI组。采用Western blot检测E-cadherin、Vimentin、NOX4的表达,用划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平。结果:TGF-β可增加BEAS-2B细胞NOX4、Vimentin的表达及ROS水平,降低E-cadherin的表达以及划痕宽度,DPI可以抑制NOX4、Vimentin的表达及ROS水平,增加E-cadherin的表达以及划痕宽度(P<0.001);DPI可拮抗TGF-β对NOX4、E-cadherin、ROS的作用(P<0.05)。结论:抑制NOX4的表达可以抑制TGF-β诱导的BEAS-2B细胞上皮间质转化,进而抑制BEAS-2B细胞的迁移能力。

云锡矿粉诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化

背景与目的研究云锡矿粉对人支气管上皮细胞的致癌转化效应,以探讨云锡矿工肺癌病因及其机制。材料与方法采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞,设200μg/ml及50μg/ml剂量的2个氧化矿染毒组和1个溶剂对照组,细胞染毒72h后,隔代染毒直至第9代。系统观察转化过程中细胞的生物学特性及血清抗性、锚着独立性生长能力等转化表型特征。结果第20代时各组细胞均未表现出血清抗性,第25代200μg/ml组细胞出现血清抗性和倍增时间增长、染色体畸变率增高;第30代时200μg/ml组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,至第40代时,200μg/ml及50μg/ml剂量组细胞均能在软琼脂上形成克隆。结论云锡矿粉能体外诱发人支气管上皮细胞恶性转化。

组蛋白乙酰化对A549和BEAS-2B细胞哮喘易感基因ADAM33的影响

目的:研究丁酸钠、曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)及腺病毒E1A相关的300 kD蛋白(adenoviral E1A binding protein of 300 kD,P300)介导的组蛋白乙酰化在人非小细胞肺癌A549细胞及人支气管上皮BEAS-2B细胞中对哮喘易感的解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因表达的影响。方法:将A549细胞及BEAS-2B细胞分别分为丁酸钠对照组(双蒸水处理)和1、2.5、5 mmol/L丁酸钠组,TSA对照组(0.1%二甲基亚砜处理)和0.2、0.4、0.8μmol/L TSA组,按照组别分别予以相应处理;另将BEAS-2B细胞分为对照组(转染P300突变质粒)和P300组(转染P300表达质粒);采用双荧光素酶报告基因法分析ADAM33启动子活性的变化,实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)检测ADAM33 mRNA表达,蛋白质印迹法检测ADAM33蛋白表达。结果:在人非小细胞肺癌A549细胞中,与对照组相比,1 mmol/L丁酸钠组及0.2μmol/L TSA组ADAM33基因启动子活性明显降低(P<0.01);在BEAS-2B细胞中,与对照组相比,1 mmol/L丁酸钠组及0.2μmol/L TSA组ADAM33基因启动子活性、mRNA及蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。加大丁酸钠、TSA药物浓度,ADAM33表达无显著差异。在人支气管上皮BEAS-2B细胞中,与对照组相比,P300组ADAM33启动子活性、mRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)。结论:丁酸钠、TSA通过组蛋白乙酰化降低人非小细胞肺癌A549细胞和人支气管上皮BEAS-2B细胞中ADAM33表达,P300通过组蛋白乙酰化降低人支气管上皮BEAS-2B细胞中ADAM33表达。

薄荷醇通过激活瞬时受体电位M8(TRPM8)促进BEAS-2B人支气管上皮细胞的细胞因子分泌

目的探讨瞬时受体电位M8(TRPM8)在薄荷醇诱导BEAS-2B人支气管上皮细胞表达气道上皮源性细胞因子白细胞介素25(IL-25)、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)中的作用及其相关信号转导机制。方法用2 mmol/L薄荷醇处理BEAS-2B细胞1、2、3、4 h,选择IL-25、IL-33、TSLP或Ca^(2+)表达较高的时间组,通过小干涉RNA(siRNA)特异性敲低TRPM8(si-TRPM8),采用细胞内钙离子螯合剂1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)及核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)处理。CCK-8法检测细胞活力;实时荧光定量PCR检测IL-25、IL-33和TSLP mRNA表达;ELISA检测培养上清液IL-25、IL-33和TSLP蛋白水平;Fluo-4 AM负载结合流式细胞术检测胞内Ca^(2+)荧光强度;Western blot法检测si-TRPM8对BEAS-2B细胞合成TRPM8蛋白的干扰效率及NF-κB p65蛋白表达的影响。结果与空白对照组比,薄荷醇组IL-25、IL-33、TSLP mRNA及蛋白、胞内Ca^(2+)水平和NF-κB p65蛋白表达均增加;敲低TRPM8后,抑制薄荷醇诱导的Ca^(2+)、IL-25、IL-33、TSLP和NF-κB p65表达增加,BAPTA-AM和PDTC均可抑制薄荷醇诱导的IL-25、IL-33和TSLP的高表达。结论薄荷醇通过激活TRPM8引起Ca^(2+)浓度升高、激活NF-κB通路诱导BEAS-2B支气管上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的分泌。

云南省宣威地区烟煤燃烧后的底灰对BEAS-2B细胞的体外毒性作用

目的评价宣威地区烟煤燃烧后的底灰对人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性作用。方法(1)应用X线荧光光谱分析法测定宣威地区烟煤燃烧后底灰中的多量元素含量,扫描电镜观察底灰中的固体物质形态;(2)应用MTT比色法检测实验组(宣威底灰处理组)、对照组(宜宾底灰处理组)和空白组的细胞成活率变化,分别测定经底灰刺激0～72 h后还原型谷胱甘肽(GSH)、细胞内活性氧化酶(ROS)和乳酸脱氢酶(LDH)含量变化。结果 (1)宣威地区烟煤燃烧后的底灰中硅(Si)、铝(Al)、铅(Pb)、砷(As)元素质量百分比高于宜宾地区(P<0.05),而硒(Se)元素质量百分比则低于宜宾地区(P<0.05)。通过扫描电镜分析,宣威烟煤燃烧后的底灰中含有大量的游离二氧化硅颗粒物,形态各异,粒径大小不一,部分为纳米级别;(2)BEAS-2B细胞成活率随煤灰暴露时间的延长而下降;BEAS-2B细胞培养基中的细胞内ROS升高,GSH下降,LDH升高,并随煤灰暴露时间延长而变化,相同时间点上实验组变化更显著(P<0.05)。结论 (1)宣威地区烟煤燃烧后的底灰中含有大量的游离二氧化硅颗粒物,形态各异,粒径部分为纳米级别;(2)宣威地区烟煤燃烧后的底灰对BEAS-2B细胞具有较强的氧化损伤作用,表现为时间-效应。

黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响

背景:氧化应激及炎症反应在急性肺损伤的发生发展过程中发挥了重要的作用,研究表明黄芩苷具有抗氧化、抗炎等生物活性。目的:探讨黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激人正常支气管上皮细胞BEAS-2B氧化应激和TXNIP/NLRP3通路的影响。方法:采用脂多糖/三磷酸腺苷联合刺激BEAS-2B细胞建立炎症模型,将细胞随机分为空白对照组、模型组和黄芩苷低、中、高剂量组(2.5,5,10 mg/L);采用MTT法检测细胞活力,ELISA法检测细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素18和肿瘤坏死因子ɑ水平,荧光探针DCFH-DA法检测各组细胞内活性氧水平,酶标仪检测超氧化物歧化酶和丙二醛水平,实时荧光半定量PCR检测TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18 mRNA的表达水平,Western blot检测细胞中TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量。结果与结论:与空白对照组相比,模型组细胞内活性氧和丙二醛水平升高,超氧化物歧化酶活性降低,细胞活力下降,细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子ɑ的分泌量和TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β、白细胞介素18的基因表达量以及TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量均显著升高。与模型组比较,黄芩苷组可显著逆转上述指标,且呈浓度依赖性。结果表明,黄芩苷可通过减轻氧化应激反应,进而抑制TXNIP/NLRP3炎症通路的激活,来发挥其对脂多糖/三磷酸腺苷联合诱导BEAS-2B细胞损伤的保护作用。

香烟凝集物通过SIRT1-FOXO3a途径诱导Beas-2b细胞凋亡

目的：近几年来，随着慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发病率和致死率的逐渐升高，对其发病机制的研究也成为迫在眉睫的重要任务。而吸烟是导致COPD发病的主要因素，因此，

5-HTR2B、E-cad、α-SMA在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达变化

目的:观察5-羟色胺2B受体(5-HTR2B)、E-钙粘素(E-cad)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)在博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化中的表达变化。方法:健康雄性SD大鼠45只,随机分为3组(n=15):对照组、BLM组、泼尼松+BLM组。各组分别于第7、14和28天各处死动物5只,取肺组织,行HE、Masson染色,观察大鼠肺组织炎症和纤维化的程度;免疫组化法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织中5-HTR2B、上皮细胞标记物E-cad和间质细胞标记物(α-SMA)mRNA及蛋白的表达水平。结果:BLM组肺组织病理切片HE和Masson染色按时间顺序呈现由肺泡炎症至纤维化的动态改变。免疫组化及RT-PCR结果显示肺纤维化大鼠肺组织中5-HTR2B、α-SMA的蛋白及mRNA表达均增加(P<0.05),28 d时最高;E-cad蛋白及mRNA表达均减弱(P<0.05),28 d时最低;泼尼松+BLM组,相应时间点5-HTR2B、α-SMA蛋白及mRNA表达有所下降(P<0.05),E-cad蛋白及mRNA表达不同程度增强(P<0.05)。结论:5-HTR2B可促进大鼠肺纤维化发生,机制可能与减弱E-cad,促进α-SMA表达,诱导上皮细胞间质转化(EMT)有关。

人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制

背景:前期研究已证实人胎盘间充质干细胞来源培养上清能够通过抑制细胞凋亡保护氧化损伤的肺上皮细胞。目的:探究人胎盘间充质干细胞来源外泌体对氧化应激损伤肺上皮细胞BEAS-2B的保护作用。方法:体外培养BEAS-2B细胞,采用含100,200,300,400,500μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基培养细胞4 h,以及用含300μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基分别培养细胞2,4,6 h,CCK-8法测定细胞存活率,以确定过氧化氢氧化损伤模型条件。Hoechst33258染色观察细胞凋亡情况,q-PCR及Western blot检测bax、bcl-2基因和蛋白的表达以确定模型的有效性。收集第3代人胎盘间充质干细胞培养上清,按照外泌体提取试剂盒说明进行外泌体提取,将外泌体作用于氧化损伤的BEAS-2B细胞,q-PCR及Western blot检测bax、bcl-2、nrf2及keap1的表达。结果与结论:①采用300μmol/L过氧化氢作用于BEAS-2B细胞4 h,细胞存活率为(51.96±2.17)%,可作为氧化损伤模型的最适条件,且Hoechst33258染色、q-PCR及Western blot证明模型有效;②与损伤组比较,外泌体组bax表达降低而bcl-2表达升高,nrf2表达升高而keap1表达降低,差异有显著性意义(P<0.05);③结果提示,人胎盘间充质干细胞来源外泌体能够抑制氧化损伤BEAS-2B细胞凋亡,其作用机制可能与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关。

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。

PM_(2.5)诱导人支气管上皮细胞线粒体损伤

流行病学和实验研究表明,PM_(2.5)会对呼吸系统造成损害,但毒性机制还有待深入探讨.本研究采集太原市冬季PM_(2.5),考察其对人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)的线粒体损伤效应.结果表明,PM_(2.5)会造成细胞线粒体结构变化和功能异常,主要表现为三磷酸腺苷(ATP)水平和线粒体膜电位(MMP)随着PM_(2.5)浓度升高而下降.此外,线粒体功能相关因子PGC-1α、NRF-1和TFAM的蛋白表达量也随着PM_(2.5)浓度的升高呈下降趋势,并在30μg·mL^(-1)时达到最小值.这些结果提示,PM_(2.5)可以导致BEAS-2B细胞发生线粒体结构和功能性变化,进而诱发呼吸系统损伤.

miR-29b/MMP2轴参与慢性阻塞性肺疾病的作用机制研究

目的探究miR-29b/基质金属蛋白酶2(MMP2)轴,在慢性阻塞性肺疾病(COPD)进展中的作用。方法采用LPS气道滴入联合烟雾法复制COPD大鼠模型,检测大鼠肺功能、血浆MMP2含量,HE观察肺组织形态学变化,qRT-PCR检测肺组织miR-29b水平;体外培养人支气管上皮样细胞16HBE,采用miRNA转染16HBE细胞干扰miR-29b的表达,实验设置Control组、miR-29b mimics组、mimics-NC组、inhibitor-NC组、miR-29b inhibitor组;qRT-PCR检测细胞中miR-29b水平确定干扰有效后,CCK-8法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测16HBE细胞中MMP2蛋白表达。结果与空白组相比,COPD大鼠肺组织损伤严重,血浆MMP2含量明显升高(P<0.05),肺组织miR-29b水平显著降低(P<0.05)。与Control组相比,miR-29b mimics组细胞miR-29b水平、细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05),划痕愈合率、MMP2蛋白表达显著降低(P<0.05);miR-29b inhibitor组细胞miR-29b水平显著降低,细胞增殖、划痕愈合率、MMP2蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论miR-29b可负调控MMP2参与COPD的进展。

白藜芦醇对脂多糖诱导的人肺上皮细胞焦亡的保护机制研究

目的:探究白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导的人肺上皮细胞(又称BEAS-2B)增殖、炎症因子释放和焦亡的影响。方法:用CCK-8法检测LPS和LPS与白藜芦醇联用对BEAS-2B细胞增殖的影响;采用ELISA法检测细胞上清炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)表达以及qPCR和Western blot检测焦亡基因NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1的表达;分析其对细胞活力、BEAS-2B细胞中细胞因子的含量及其焦亡相关基因、相关蛋白表达的影响。结果:LPS可以抑制BEAS-2B细胞的增殖,同时可以促进炎症因子的表达,经qPCR和Western blot检测结果表明LPS可以促进NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1基因的表达;其经用白藜芦醇处理48 h后,可以有效逆转LPS所引起的细胞增殖受抑制和炎症因子高表达的现象;此外,NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1的表达也部分受抑制。结论:白藜芦醇通过减少炎症因子的释放和NLRP3、Gasdermin D、Caspase-1、ELAVL1表达对LPS诱导的BEAS-2B焦亡起到一定的保护作用。

塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化(一)

目的 研究塞替派对人类支气管上皮细胞的致癌转化效应。方法 利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS 2B)为靶细胞模型 ,以塞替派诱导BEAS 2B细胞的恶性转化 ,并伴随研究了塞替派转化细胞 (EBAS TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征。结果 经传代和软琼脂培养基筛选 ,BEAS TE具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性。结论 塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应。

空气细颗粒物通过补体C3a/C3aR轴诱导上皮细胞炎症

目的探讨空气细颗粒物(PM2.5)诱导上皮细胞炎症反应的潜在机制。方法人正常肺支气管上皮细胞Beas-2b细胞暴露于不同剂量PM2.5(0、25、50、100μg/ml)24 h后,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、白细胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-1β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF),以及补体C3(complement component 3)、C3a及其受体C3aR表达水平。并利用C3aR拮抗剂处理Beas-2b细胞验证其对PM2.5诱导的炎症水平的抑制作用。结果PM2.5暴露诱导上皮细胞中TSLP、IL-6、IL-8、IL-1β和GMCSF表达显著上调,并诱导细胞中补体C3、C3a和C3aR的基因和蛋白水平显著增加。而C3aR拮抗剂处理可显著抑制PM2.5诱导的Beas-2b细胞中TSLP、IL-6、IL-8和IL-1β的增加。C3aRA也可下调PM2.5诱导的GMCSF表达增加,但差异无统计学意义。结论PM2.5可能通过补体C3a/C3aR轴诱导上皮细胞炎症反应。

人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变的研究

目的:研究在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中染色体畸变,探讨其在吸烟高危人群罹患肺癌预警及普查方面的意义。方法用NNK诱发BEAS-2B细胞(BEAS-2BNNK)恶性转化,并在此过程中用常规中期染色体分析方法,动态观察染色体畸变的情况。结果:1．NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立①BEAS -2BNNK(实验组)第5代细胞血清抗性显著增强。②第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性。③第20代BEAS -2BNNK细胞超微结构出现明显异型性。④第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理为高分化鳞形细胞癌。2．染色体畸变①BEAS-2B(对照组)二倍体细胞占细胞总数的91％-97％,传代后核型稳定;从第5代开始BEAS-2BNNK细胞即逐渐失去正常核型,随着传代次数增加,二倍体细胞比例从83％递减至54％,异倍体及多倍体细胞呈递增趋势,较对照组明显增高。②各代BEAS-2B细胞结构畸变发生率为2％-4％;除第5代BEAS-2BNNK细胞结构畸变总频率(11％)明显高于BEAS -2B细胞外,其余各代细胞与BEAS-2B细胞相近。结论:NNK能成功诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞恶性转化, 为进一步探讨肺癌发生机制、尤其是吸烟致肺癌发生机制提供了理想模型。染色体的异倍性和多倍性在NNK诱发BEAS- 2B细胞转化成肺癌过程中可能属早期事件,有望成为吸烟高危人群罹患肺癌的预警及普查指标之一。

塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中的基因突变(二)

目的 观察抗癌药物塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中相关基因的突变并分析其意义。方法 以塞替派作为致癌原诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B) ,获得转化细胞 (BEAS TE)和克隆化多倍体癌前转化细胞 (BEAS STE)。采用PCR SSCP法检测上述 3种细胞p5 3、p16和Ki ras 3种基因是否出现点突变 ,进一步测序确定其突变情况。结果 SSCP结果阳性的有BEAS TE细胞p5 3第 7外显子 ,BEAS STE细胞p5 3第8外显子以及这二种细胞的p16基因第 1外显子 ;Ki ras基因第 1外显子的结果仅为可疑阳性。测序证明 ,p5 3、Ki ras基因存在多位点的碱基突变 ,而p16基因仅为单位点的碱基突变。结论 塞替派可诱发人支气管上皮细胞p5 3、Ki ras多位点的碱基突变和p16的单位点突变。分析前者为塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件 。

人支气管上皮细胞恶性转化过程中FHIT蛋白表达的研究

背景与目的目前大多数研究者分别研究了正常支气管上皮、癌前病变及肺癌组织(吸烟或不吸烟者)标本FHIT蛋白表达,而没有在肺癌发生发展过程中研究其表达及意义。本研究的目的是在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS2B)恶性转化过程中,探讨FHIT蛋白表达的变化及其意义。方法用500mg/LNNK诱发BEAS2B细胞(对照组)恶性转化为BEAS2BNNK细胞(实验组),并在此过程中用免疫细胞化学方法动态观察FHIT蛋白表达的情况。结果㈠NNK诱发BEAS2B细胞恶性转化模型的建立:①第5代BEAS2BNNK细胞血清抗性显著增强;②第15代BEAS2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性(软琼脂克隆形成);③第20代BEAS2BNNK细胞超微结构出现明显异型性;④第25代BEAS2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理类型为高分化鳞癌。㈡FHIT蛋白表达:BEAS2B细胞FHIT蛋白表达稳定,在各代之间的差异无统计学意义(P>0.05);第5代BEAS2BNNK细胞FHIT蛋白表达即有所降低,并随传代次数增加而进行性下降,但第25代细胞FHIT蛋白却呈高表达。结论①500mg/LNNK能成功诱发BEAS2B细胞恶性转化,为进一步探讨肺癌尤其是吸烟致肺癌的发生机制提供了理想模型。②FHIT蛋白表达减弱在肺癌发生过程中可能属早期事件,但FHIT蛋白在细胞恶性转化晚期上调表达值得进一步研究。