WP1066对人气道上皮细胞增殖的影响及机制

目的研究信号转录和激活因子3(signal transduction and transcription activator3,STAT3)抑制剂WP1066对人气道上皮BEAS‑2B细胞增殖的影响及分子机制,探讨WP1066治疗支气管哮喘疾病发病的潜在机制。方法WP1066处理BEAS‑2B细胞,应用MTT法测定细胞增殖,Western Blot测定STAT3磷酸化水平及其下游靶点Cyclin D1表达水平。结果WP1066可抑制BEAS‑2B细胞的增殖,其抑制作用呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05);WP1066处理细胞并不会降低总的STAT3蛋白水平,但可抑制STAT3磷酸化水平,抑制下游Cyclin D1蛋白表达。结论WP1066可通过阻断STAT3信号通路,从而抑制人气道上皮细胞增殖。

核转录因子κB在TNF-α诱导人气道上皮细胞hBD-2表达中的作用

目的观察肿瘤坏死因子-α(TNFα-)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及核转录因子κB(NFκ-B)在hBD-2表达中的作用。方法用TNFα-和或NFκ-B抑制剂PDTC处理体外培养人气道原代上皮细胞,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,W estern b lot检测细胞质IκBα-蛋白活性变化,凝胶迁移试验(EMSA)检测不同时相NFκ-B活性的变化。结果TNFα-刺激0.5 h后可见人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,并呈时间依赖性;PDTC可抑制hBD-2mRNA表达;NFκ-B在TNFα-刺激1 h后明显活化,抗体超迁移率实验结果显示p65-p50异型二聚体NFκ-B参与了NFκ-B的活化。结论一定剂量的TNFα-可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,NFκ-B在TNFα-诱导气道上皮细胞hBD-2mRNA起重要的调控作用。

布地奈德对人气道上皮9HTEo-细胞增殖的影响及机制

探究布地奈德（budesonide,BUD）对人气道上皮9HTEo-细胞增殖的影响及机制,利用CCK-8法检测BUD对9HTEo-细胞增殖的影响,荧光显微镜观察经BUD处理后9HTEo-细胞形态的改变,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测p27kip1蛋白表达.CCK-8法结果显示3-10μmol/L BUD对细胞具有显著的抑制作用（P〈0.01）;荧光显微镜下,1-10μmol/L BUD处理后细胞可见明显的增殖受抑、凋亡形态;流式细胞术检测G0/G1期细胞随着BUD浓度的增加而增多,S期细胞逐渐减少;Western blot检测结果提示BUD能使p27kip1表达增加.由此可见,BUD对人气道上皮细胞株9HTEo-具有显著增殖抑制作用,其作用与提高p27kip1蛋白的表达,将细胞阻滞在G0/G1期有关.

分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响

目的:探讨不同滴度的分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响。方法:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞后,采用倒置显微镜观察细胞生长形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子分泌水平,RT-PCR和Western blot分别检测上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA和蛋白表达水平。结果:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞一段时候后,细胞的生长形态、存活率、凋亡率、细胞因子分泌水平以及黏蛋白MUC5AC表达与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:分枝杆菌噬菌体Chy3无论高低滴度对体外培养人气道上皮细胞生长和功能均无明显影响,有较好的安全性。

灵芝孢子粉对脂多糖诱导的人气道上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨灵芝孢子粉对脂多糖(LPS)诱导细胞损伤的保护作用及机制。方法对16HBE细胞体外培养,分别给予不同剂量灵芝孢子粉预保护24 h后,给予LPS(1μg/ml)刺激6 h,采用MTT法检测气道上皮细胞活性,检测细胞上清液中的超氧化歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素-6(IL-6)等。采用Western印迹检测细胞内核因子(NF)-κB蛋白表达。结果灵芝孢子粉可明显提高人气道上皮细胞的活力,显著降低细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6;显著提高SOD的含量;并显著降低细胞内NF-κB蛋白表达。结论灵芝孢子粉对LPS诱导的人气道上皮细胞损伤有保护作用。

羧甲司坦对人气道上皮细胞炎症的影响及调控机制研究

目的通过比较羧甲司坦单用或联合布地奈德对人气道上皮细胞炎症的影响探讨其调控机制。方法MTT法检测不同浓度烟雾提取物(CSE)对细胞生存率的影响。给予不同药物抑制剂和激动剂干预后,检测炎症因子水平、ERK和IκBα蛋白,以及ERK和NF-κB mRNA的表达。结果模型组炎症因子水平、p-ERK和p-IκBα蛋白,以及ERK和NF-κB mRNA表达均增高;用药组上述指标较模型组均有所改善,但用药组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。羧甲司坦、PD98059干预后p-ERK蛋白及ERK、NF-κB mRNA水平均降低,而给予EGF干预后上述指标较羧甲司坦组有所回升。结论羧甲司坦的抗炎机制可能与糖皮质激素存在重叠,基础应用糖皮质激素者由于抑制了相同的信号转导通路,故再联合应用羧甲司坦时效果不佳。

白三烯诱导人呼吸道上皮细胞氧化应激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究

目的研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用。方法将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组。暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h。检测对照组及暴露组在2、4、6、12 h相应指标。测定气道上皮细胞内谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量;双酶法测定γ-GCS活性;RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达;Western-blot检测气道上皮细胞核和细胞质中γ-GCS蛋白表达;细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白表达。结果暴露组细胞2、4、6、12 h的GSH含量、GSH/GSSG比值先减少后逐渐增加,4 h最低,6 h达最高,12 h恢复正常;而GSSG含量则呈现相反趋势,与对照组之间差异有统计学意义。暴露组细胞2、4、6 h,γ-GCS活性增强,与对照组比较差异有统计学意义。细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白阳性信号主要分布在胞质中,暴露组呈强阳性表达,而对照组表达较弱,暴露组2、4、6 h时与对照组比较,差异有统计学意义。Western-blot检测结果相似。RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达,暴露组2、4、6 h时较对照组增加,差异有统计学意义。结论白三烯诱导氧化应激影响呼吸道上皮细胞谷胱甘肽氧化还原状态,而呼吸道上皮细胞通过提高γ-GCS活性对抗氧化应激,保持氧化还原稳定的状态。

25羟维生素D_3对支气管上皮细胞维生素D受体表达及分布的影响

目的探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮维生素D受体表达及分布的影响。方法选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响;实验组分为对照组和不同浓度25羟维生素D3处理组。各处理因素作用细胞时间为24 h。用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光法观测各处理组维生素D受体(VDR)mRNA及蛋白表达、分布的情况。结果与对照组相比,各个不同处理浓度的25羟维生素D3对VDR的表达量及分布均无显著增加(P>0.05)。结论 25羟维生素D3对支气管上皮细胞的影响可能并不依赖于VDR的表达及转位。

抑癌基因WWOX在肺腺癌细胞株A549中表达的研究

目的:检测WWOX(WW domain containing oxidoreductase)基因在肺腺癌细胞株A549中的变化及其意义.方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、聚合酶链反应结合二核苷酸重复序列多态性方法、免疫印迹分析(Western blot)方法分别对WWOX基因6～8外显子在A549细胞转录本丢失、杂和性丢失(LOH)和WWOX蛋白表达异常进行检测.结果:A549细胞样本为WWOX基因6～8外显子转录本的丢失,而在对照的原代培养人气道上皮细胞样本(简称原代培养)未发现WWOX基因的6～8外显子的丢失(P<0.05);A549细胞样本中存在D16S3029及D16S3096两个微卫星位点的LOH 而对照的原代培养中无WWOX基因的杂合性丢失(P<0.05);Western blot结果显示WWOX基因在A549细胞的蛋白表达(A值为817464.90±64916.64)明显低于在原代培养中的蛋白表达(A值为2150142.00±64916.64)(P<0.01).结论:WWOX基因可能在肺腺癌的发生发展中起重要作用;转录本丢失、LOH及蛋白低表达均可能是WWOX基因在肺腺癌中的失活方式.

基于NF-κB信号通路探讨芍药苷对黏蛋白5AC分泌的调控作用

目的:基于NF-κB信号通路探讨芍药苷调控气道黏蛋白5AC(MUC5AC)合成与分泌的影响及作用机制。方法:体内通过烟熏和慢性感染相结合的方法复制慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期大鼠模型,体外通过IL-1β诱导人气道上皮H292细胞建立炎症模型,设置空白组、模型对照组、NF-κB通路抑制剂组(PDTC组)、芍药苷组。采用动物肺功能测量仪检测大鼠肺功能;ELISA检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、血清以及细胞上清中MUC5AC以及炎症因子IL-8、TNF-α表达水平;免疫印迹试验检测细胞P65、核因子κB抑制蛋白(IκB)蛋白表达水平;反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组细胞MUC5AC mRNA、囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)mRNA表达水平。结果:与空白组比较,模型对照组大鼠呼吸频率(f)、呼气峰流值(PEF)、潮气量(VT)、呼吸阻力(Rin)均显示有明显差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,PDTC组、芍药苷组大鼠PEF、VT、Rin有明显改善(P<0.05),PDTC组呼吸频率(f)明显降低(P<0.05);与空白组比较,模型对照组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、血清以及细胞上清中MUC5AC、IL-8、TNF-α含量均明显增加(P<0.05),体外模型组细胞中P65蛋白和MUC5AC mRNA表达升高(P<0.05),IκB蛋白降低(P<0.05);与模型组比较,PDTC组、芍药苷组大鼠中BALF、血清及细胞上清中MUC5AC、IL-8、TNF-α含量均明显降低(P<0.05),且PDTC组、芍药苷高低剂量组的细胞中IκB蛋白和MUC5AC mRNA表达升高(P<0.05),P65蛋白和CFTR mRNA表达降低(P<0.05)。结论:芍药苷可改善COPD急性加重期大鼠模型的肺功能,减轻气道炎症反应,其机制与抑制NF-κB信号通路活性,降低气道细胞炎症因子分泌量以及调控MUC5AC mRNA、CTFR mRNA和相关蛋白的表达有关。

脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1的表达研究

目的探讨脂多糖(LPS)诱导人气道上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)的表达情况。方法体外培养人气道上皮细胞,将其随机分为阴性对照组、LPS组及Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk)+LPS组(简称cmk+LPS组)。采用四氮唑盐(MTT)法测定各组细胞的增殖能力;实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞Caspase-1mRNA的表达水平;Western-blot测定各组细胞Caspase-1蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞上清液白介素1β(IL-1β)水平。结果 3组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05);LPS组Caspase-1mRNA的表达水平较cmk+LPS组和对照组增高,3组间差异有统计学意义(P<0.05);LPS组Caspase-1蛋白的表达明显高于对照组和cmk+LPS组,3组间差异有统计学意义(P<0.05);LPS组IL-1β水平高于对照组和cmk+LPS组,3组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NLRP3炎症复合体诱导的Caspase-1活化参与人气道上皮细胞LPS的致敏过程,并促进下游IL-1β的生成。

白色念珠菌感染诱导人气道上皮细胞的损伤机制

目的探讨不同产膜能力白色念珠菌入侵后诱导人气道上皮细胞的免疫损伤机制。方法选择2019年6至12月宁夏医科大学总医院分离培养的25株白色念珠菌,质控菌株SC5314为标准菌株。建立白色念珠菌生物膜体外模型,利用结晶紫染色和酶标板法检测不同白色念珠菌的生物膜形成能力;采用酶标板法测定570 nm处的吸光度值(A_(570)):A_(570)≥0.5为强产膜菌(SBF),0.25<A_(570)<0.5为中产膜菌(DRF),A_(570)≤0.25为不产膜菌(WBF)。在体外分离培养并建立人气道上皮细胞的气液相培养模型,分为5组:空白对照组(n=20)、标准菌株组(n=20)、强产膜组(n=19)、不产膜组(n=17)、耐氟康唑组(n=18)。扫描电镜观察气液相培养上皮细胞的形态。采用免疫荧光检测气液相培养上皮细胞体外模型标志蛋白的表达。通过微孔板法检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)含量,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液中细胞内β-防御素(hBD2)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等的分泌情况。结果强产膜菌株以菌丝相互交错生长,能看到极少数酵母细胞包裹于其中。扫描电镜观察气液相培养的上皮细胞菌丝能够主动入侵上皮细胞;纤毛乙酰化的微管蛋白和角蛋白的表达量明显减少,同时细胞增殖相关蛋白的表达也被下调。空白对照组、标准菌株组、强产膜组、不产膜组、耐氟康唑组细胞中LDH含量分别为(12.21±5.68)、(46.35±6.35)、(18.69±4.38)、(12.56±3.69)、(13.48±4.28)U/L,差异有统计学意义(P<0.001);与标准菌株组相比,强产膜组、不产膜组、耐氟康唑组细胞内LDH含量均降低(均P<0.01)。空白对照组、标准菌株组、强产膜组、不产膜组、耐氟康唑组细胞内hBD2的含量分别为(26.14±0.77)、(56.18±0.83)、(30.66±2.59)、(29.22±0.48)、(28.28±1.56)ng/L,差异有统计学意义(P<0.001);与空白对照组相比,只有标准菌株组的上皮细胞可诱导细胞内hBD2表达量增加(P<0.001)。不同组别间细胞内GM-CSF、G-CSF的表达量差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论强产膜白色念珠菌可通过下调细胞增殖相关蛋白的表达,抑制细胞的增殖,破坏上皮细胞的完整性,从而诱导细胞损伤。

香烟烟雾提取物可以减少人气道上皮细胞分泌血管内皮生长因子

研究人员发现在重度肺气肿患者的肺泡灌洗液中血管内皮生长因子（VEGF）含量明显降低。气道上皮细胞暴露于各种环境因素，如香烟烟雾及细菌等。但是，这些因素缘何能使分化良好的人气道上皮细胞分泌VEGF减少的原因仍不明确。

脂多糖诱导气道上皮细胞过氧化物氧化还原酶1的表达

目的探讨脂多糖（LPS）作用于气道上皮细胞后对过氧化物氧化还原酶1（prdx1）表达的影响。方法培养正常人气道上皮细胞株BEAS-2B，以0、1、10mg／LLPS作用于气道上皮细胞12h和24h后，用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测prdx1 mRNA表达；以0、0．1、0．5、1、5、10mg／L LPS作用于气道上皮细胞12h后，用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测prdx1蛋白表达。结果RT—PCR结果显示：LPS作用于细胞12h内，随着LPS作用剂量的增加，prdx1 mRNA表达增高，10mg／LLPS作用12hprdx1 mRNA表达较对照组显著增加（2．014±0．197比0．644±0．178，P〈0．05）；但随着LPS作用时间的延长，24h时prdx1 mRNA表达有所回落。Western blotting结果显示，随着LPS作用剂量的增加，prdx1蛋白表达逐渐增高，5mg／L LPS作用12h时prdx1蛋白显著高于对照组（1．069±0．175比0．328±0．010，P〈0．05），10mg／LLPS作用12h时维持在高水平（0．984±0．220）。结论10mg／L的LPS作用于BEAS-2B细胞12h后可诱导prdx1的基因和蛋白表达增加。

糖原合成酶激酶3参与尼古丁调控支气管上皮细胞促纤维因子的分泌

目的本研究旨在探讨尼古丁是否通过糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性变化及其对β-连环素信号的影响调控气道上皮细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）、血小板衍生生长因子AB（PDGF—AB）和PDGF-BB分泌。方法尼古丁（6×10μmol／L）刺激人气道上皮细胞株（16HBE），采用Western blotting方法检测刺激24h后细胞中GSK3β和抑制性磷酸化GSK3β（P—GSK3β）的表达水平。预先加入10μmol／LGSK3~特异性抑制剂SB216763孵育1h，再加入尼古丁刺激16HBE24h，细胞免疫荧光和Western blotting方法检测D-连环素胞浆和胞核的表达，用酶联免疫吸附试验检测MMP-9、PDGF-AB和PDGF-BB分泌。结果尼古丁刺激24h后P—GSK313的表达较未予尼古丁刺激的正常对照组明显升高，GSK3β的表达下降。加入SB216763后尼古丁刺激24h组，β-连环素胞浆和胞核的表达较尼古丁组明显增加，同时MMP-9、PDGF-AB和PDGF—BB分泌量显著增加。结论GSK3β／β-连环素信号通路参与了尼古丁调控支气管上皮细胞MMP-9、PDGF—AB和PDGF-BB分泌。

反义硫代修饰寡核苷酸体外抗呼吸道合胞病毒感染的研究

目的 :在感染呼吸道合胞病毒 (RSV)的 9HTE细胞中观察与RSVNS1基因和M2基因互补的反义硫代寡核苷酸的抗病毒活性。方法 :直接观察RSV的致细胞病变作用 ,用MTT方法测定细胞存活率。结果 :1.RSV感染复数 (moi)在 0 .1以上时 ,培养 5天后RSV感染的 9HTE细胞全部死亡。 2 .我们设计的反义核酸能够提高感染细胞的存活率 ,且呈量效依赖关系。结论 :反义硫代寡核苷酸具有较明显的抗病毒活性 ,为进一步研究新型抗RSV药物奠定了基础。

维生素D缺乏与儿童反复呼吸道感染的关系及机制

呼吸道感染是常见的儿科疾病,有着显著的发病率和死亡率,反复呼吸道感染会严重影响儿童的生活质量和身体健康。维生素D具有一系列与人体健康有关的作用,包括与呼吸道的感染有关。为了分析维生素D与儿童反复呼吸道感染的关系,探讨维生素D影响呼吸道感染的机制,本研究通过临床分析了维生素D缺乏与儿童反复呼吸道发生之间的相关性,通过构建炎症模型,观察了外源维生素D对人气道上皮细胞增殖分化的影响,运用ELISA检测了维生素D对人气道上皮细胞和中性粒细胞释放炎症因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)的影响。本结果表明,维生素D缺乏与儿童反复呼吸道感染相关,并且维生素D能促进人气道上皮细胞的增殖分化,但对人气道上皮细胞和中性粒细胞炎症因子的产生无显著影响。

反义硫代修饰寡核苷酸体外抗甲型流感病毒感染的效应研究

目的在感染甲型流感病毒（influenza Avirus，IFAV）的人气道上皮细胞（9HTEO）中观察与IFAV PB1、M2、NS、PB2、HA基因互补的反义硫代修饰寡核苷酸（ASODN）的抗病毒活性。方法细胞外体系观察设计的ASODN效率，筛选对IFAV有效的3个ASODN进行9HTEO的抗病毒效应。倒置显微镜下观察IFAV的致细胞病变作用和ASODN的细胞保护作用。MTT方法测细胞存活率，空斑试验、RT．PCR、Westernblot、免疫荧光检测ASODN特异性抗病毒效应，MTF法检测ASODN对细胞的保护作用。结果IFAV感染复数（MO!）在0．1以上时，培养5d后IFAV感染的9HTEO细胞全部死亡。设计的ASODN能够提高感染细胞的存活率，且呈量效依赖关系。空斑试验、RT．PCR、Westernblot、免疫荧光试验证实在细胞水平、基因转录水平、蛋白水平针对IFAV PB1、M2、NS基因mRNA转录起始点保守序列设计的ASODN具有特异性抗IFAV作用。结论ASODN具有较明显的抗病毒活性，为进一步研究和开发新型抗IFAV药物提供了实验依据。为高致病性禽流感（H5N1）的基因治疗提供了新的思路和理论依据。