α-Enolase抑制人泡沫病毒反式激活因子Bell介导的反式激活作用

泡沫病毒能在宿主细胞内长期潜伏感染,且不伴随任何病理现象.为了阐明这一病毒潜伏感染机制,关键要研究病毒与其宿主之间的相互影响,尤其是宿主对病毒基因转录水平的影响.Bel1是人泡沫病毒的反式激活因子,它能够激活该病毒LTR和IP两个转录启动子.该研究利用酵母双杂交技术筛选到Bel1的相互作用蛋白α-Enolase,并用免疫共沉淀技术确定了这两个蛋白的结合涉及α-Enolase的243～372位氨基酸及Bel1的223～275位氨基酸.细胞转染实验发现α-Enolase蛋白能够抑制Bel1介导的反式激活作用.

人泡沫病毒介导IL-24对肿瘤细胞的抑制作用

目的:利用重新构建的人逆转录病毒四载体系统共转染人胚肾细胞获得携带IL-24的复制缺陷型重组人泡沫病毒(HFV-IL24)颗粒,探讨复制缺陷型人泡沫病毒介导IL-24对肿瘤细胞生长分化的抑制作用。方法:重组构建含IL-24的人泡沫病毒载体质粒(pΔΦ-IL24);与辅助质粒共转染人胚肾HEK293T细胞后获取重组病毒颗粒(HFV-IL24);RT-PCR检测目的基因的表达;MTT法检测人宫颈癌HeLa细胞的体外增殖水平,台盼蓝染色计数检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞活性和周期变化。结果:成功构建含IL-24的人泡沫病毒载体(pΔΦ-IL24);收获得到复制缺陷型重组人泡沫病毒颗粒(HFV-IL24);感染后的HeLa细胞显示出明显的生长抑制现象(P<0.01)并呈现周期变化和较高的凋亡(死亡)率。结论:所构建的重组病毒载体pΔΦ-IL24及由此而产生的重组人泡沫病毒颗粒(HFV-IL24)的功能性检测加深对HFV和抗癌基因IL-24的了解,为泡沫病毒载体的应用和IL-24抗肿瘤的基因治疗提供了研究方向和理论依据。

介导GAD基因的人泡沫病毒载体的构建及其应用

构建了两种新的重组人泡沫病毒载体pGPSNI-hGAD67和pGPSNI-hGAD65,分别携带人谷氨酸脱羧酶(GAD)的两种同工酶GAD65和GAD67基因,并研究其在帕金森病(PD)模型鼠丘脑底核中的表达及对帕金森病的治疗作用.RT-PCR结果表明,人泡沫病毒载体成功地介导了GAD65基因和GAD67基因在PD模型鼠丘脑底核中有效表达.动物行为检测表明,GAD65基因导入组PD模型鼠行为与对照组相比得到明显的改善(n=12,p<0.01).

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.

灵长类泡沫病毒的调查研究及现状

文中介绍了泡沫病毒SFV及HFV的病毒检测结果,表明该病毒在非洲、美洲、亚洲有广泛传播。实验室感染NHP虽未见临床症状,但受染宿主的细胞学变化揭示了隐性感染特征。作者讨论了逆转录RNA病毒的易变性,对泡沫病毒进一步研究的重要性。

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 。

人泡沫逆转录病毒介导的siRNA抑制HBV基因表达与复制

本研究采用基于PCR技术的siRNA表达方法,快速筛选到两个可以抑制HBV基因表达的siRNAs序列:S2和X1.S2和X1被克隆到人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)载体中,构建成为分别表达S2和X1的单表达载体和同时表达S2和X1的双表达载体.将siRNAs表达载体转导入HepAD38细胞系中,多种检测分析的结果表明这些siRNA表达载体可以有效抑制多个HBV基因的表达和病毒DNA复制;并且其抑制作用是长期的,可以持续到转导后3个月.