低剂量γ射线辐照对人淋巴母细胞基因表达转录谱的影响

为探讨低剂量电离辐射生物效应作用机制,本文研究了不同剂量单次辐照后,人淋巴母细胞基因表达转录谱的变化。采用0.1 Gy、0.5 Gy和1.0 Gy剂量的γ射线照射人淋巴母细胞,未照射细胞为对照组。照射后4 h提取细胞总RNA,用含有45 033个基因的人类全基因组表达谱芯片检测分析。对差异表达基因进行层次聚类分析、基因本体论分析和通路分析,并用实时荧光定量PCR验证。结果表明,3个剂量组均上调表达的基因1330个,下调表达的基因1002个。基因表达量与吸收剂量相关的基因共18个,其中与剂量正相关的基因16个,负相关的基因2个。层次聚类分析结果表明,4个实验组中,0.1 Gy和1.0 Gy照射组差异表达基因相似程度最高。这些差异表达的基因涉及到多条通路,如细胞周期、p53信号通路、碱基切除修复、RNA转运和内质网蛋白加工等。实时荧光定量PCR检测结果表明,CASP9(caspase 9)mRNA在照射后4 h随吸收剂量表达变化与基因芯片检测结果一致。基因芯片筛选出的差异表达基因有助于阐明低剂量辐射生物效应作用机理,与辐射剂量相关的差异表达基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物剂量计。

低剂量γ-射线照射人淋巴母细胞诱导BTG2基因mRNA变化

为观察低剂量γ-射线对人淋巴母细胞AHH1 B细胞转位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)基因m RNA表达水平的影响,探讨BTG2基因作为低剂量范围辐射生物剂量计的可能性,采用0-1.0 Gyγ-射线照射人淋巴母细胞,照射后不同时间点(0-72 h)提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BTG2基因的表达变化,分析该基因的时间-剂量效应关系。结果表明,照射后BTG2基因转录水平表达在低剂量范围呈剂量依赖增加,照射后24 h达峰值,之后逐渐下降,在48 h和72 h时处于平台期,在168 h恢复至初始水平。BTG2基因对低剂量电离辐射敏感,有较好的剂量效应和时间效应关系,具有开发为低剂量辐射生物剂量计的潜力。

NPM基因在人淋巴母细胞中的差异表达与染色体不稳定性

目的:研究NPM基因与染色体不稳定性(CIN)、细胞增殖及p53的关系,为阐明恶性血液病发生的分子机制提供参考。方法:采用软琼脂克隆形成法、常规染色体分析和G显带法检测人淋巴母细胞TK6(wtp53)、WTK1(mtp53)和正常人淋巴细胞永生化细胞(HNILL)的细胞增殖、染色体数量变化和5号染色体质量排,并观察Olomoucine对其的影响;用Sanger测序法和Western Blot方法分别测定NPM第12外显子的DNA序列、NPM蛋白和磷酸化蛋白的表达。结果:WTK1细胞的克隆形成能力和多倍体率均显著高于TK6细胞,同时WTK1细胞的NPM蛋白和磷酸化蛋白表达亦明显高于TK6细胞,且它们均又显著高于HNILL细胞;3株细胞均未发现5号染色体的重排和NPM第12外显子编码区的突变。用Olomoucine抑制NPM蛋白磷酸化后WTK1细胞的多倍体率明显降低。结论:WTK1、TK6和HNILL细胞的增殖能力、CIN与NPM蛋白和磷酸化蛋白表达呈正相关,而且与p53状态密切相关。

X射线对人淋巴母细胞基因表达谱的影响

目的应用基因芯片分析X射线对人淋巴母细胞基因表达的影响,为阐明辐射生物效应的作用机制提供理论依据。方法应用基因芯片分析人淋巴细胞经0.5和2 Gy X射线照射后的基因表达情况,通过Real-time PCR对部分差异表达基因进行验证。结果人淋巴母细胞经0.5和2 Gy X射线照射后6h差异表达基因分别有1250和1773个,照射后20 h差异表达基因分别有1076和690个。通过Real-time PCR验证差异表达的基因PERP与基因芯片结果一致,与对照组相比表达下调。结论电离辐射诱导差异表达的基因与照射剂量和照后时间相关,本研究为寻找新型辐射生物剂量计和研究辐射生物效应机制提供了新的理论依据。

^(60)Co γ射线照射正常人淋巴母细胞诱导CDKN1A基因mRNA表达水平的变化

目的探讨不同剂量60Coγ射线在不同培养时间后对人淋巴母细胞AHH-1细胞CDKN1A基因mRNA表达的影响。方法用不同剂量(0、0.2、1、3、5、10Gy)的60Coγ射线照射正常人淋巴母细胞AHH-1细胞,在不同维持存活培养时间(0、4、24、48、72、96 h)内收集细胞,抽提总RNA,用实时PCR方法检测细胞中CDKN1A基因mRNA表达水平,观察其随辐照剂量和培养时间的变化。结果 AHH-1细胞中CDKN1A基因mRNA的表达水平随辐照剂量的加大而增加,在0～5 Gy之间具有一定剂量依赖性关系(P<0.05);辐照后培养24 h时基因表达达到峰值,24 h之后呈现下降趋势。结论不同剂量γ射线照射人AHH-1细胞会导致CDKN1A基因表达水平在培养24 h内随辐射剂量增加而升高,这种剂量依赖性关系可能适用于电离辐射剂量的估算。

四君子汤抗辐射有效部位的筛选

目的观察四君子汤不同提取部位对受照淋巴母细胞AHH-1和小鼠的辐射防护作用,发现四君子汤抗辐射的有效部位。方法运用CCK-8试剂盒检测四君子汤不同提取部位作用48h对AHH-1细胞的毒性作用,及预处理AHH-1细胞2h后对经4Gy ^(60)Coγ射线照射细胞存活率的影响。BALB/C小鼠分为阴性对照组、照射对照组以及四君子汤水提取物组、乙醇提取物组、水提醇沉50%、60%、70%部位组。3.5Gy ^(60)Coγ射线全身单次照射造成小鼠电离辐射损伤模型。照射后3d和7d,观察四君子汤不同提取部位对小鼠体质量、脾脏系数、脾细胞凋亡率的影响。结果与对照组比较,250μg·ml^(-1)的四君子汤水提取物、500、1000μg·ml^(-1)的水提醇沉50%部位、1000μg·ml^(-1)水提醇沉70%部位可显著提高受照AHH-1细胞的存活率(P<0.05);水提取物、乙醇提取物、水提醇沉50%部位能够有效促进照后3d小鼠体质量的恢复(P<0.05);水提醇沉70%部位可有效抑制照后3d、乙醇提取物组及水提醇沉50%部位可有效抑制照后7d小鼠脾脏损伤并显著升高受照小鼠的脾脏系数(P<0.05),四君子汤各部位对于照后3d及7d小鼠的脾细胞凋亡均有显著的抑制作用(P<0.05),其中水提醇沉70%部位作用最明显。结论四君子汤水提醇沉70%部位可能是四君子汤抗辐射活性的主要部位。

X射线照射AHH-1细胞基因表达转录谱变化研究

目的应用基因芯片分析X射线照射对来源于人正常淋巴母细胞系的AHH-1基因表达的影响。方法照射组采用基因芯片分析0．1、0．5、2．0、5．0Gy X射线（设为相应的剂量组）照射AHH-1后培养20h基因表达谱的改变，另设1组未照射组为对照组。将照射组与对照组细胞的基因表达量差异比值〉2．0或〈0．5确定为有效差异表达基因。用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和实时聚合酶链反应（Real—timePCR）方法验证部分差异表达基因。结果照射组共同表达上调的基因有19个，共同表达下调的基因有22个。不同剂量组基因差异表达的倍数变化幅度较大，从下调0．05倍到上调13．12倍，但大部分在下调0．30—0．50倍和上调2．00—3．00倍，其中共济失调一毛细血管扩张突变基因在0．1和0．5Gy剂量组表达上调，细胞周期依赖性激酶抑制1A基因（CDKNlA）在2．0和5．0Gy剂量组表达上调。RT—PCR检测结果与基因芯片结果相一致，包括CDKN2A基因、肿瘤坏死因子受体超级家族19基因（TNFRSF19）、核糖核酸酶7基因（RNASE7）和早期生长反应因子3基因（EGFR3），Real—timePCR证实照射后TNFRSF19的表达下降。结论不同剂量x射线照射对AHH-1细胞多种功能基因的表达产生了影响，照射后差异表达基因参与不同的生物学过程。

Rad51基因沉默对铅诱导TK6细胞DNA双链断裂损伤修复的影响

目的研究Rad51基因沉默后对醋酸铅染毒致人淋巴母细胞(TK6细胞)DNA双链断裂损伤的修复作用的影响。方法构建Rad51沉默慢病毒载体及阴性对照,感染对数期TK6细胞,荧光定量PCR和Western blot验证感染效果。运用480μmol/L的醋酸铅染毒TK6细胞24 h(Control组、shRNA-NC组和shRNA-Rad51组),采用免疫荧光法检测TK6细胞的磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的表达,Western Blot检测TK6细胞的Rad51、BRCA1、53BP1蛋白的表达。结果 shRNA-Rad51组的Rad51 mRNA表达水平和Rad51蛋白表达水平均低于Control组及shRNA-NC组(P <0.01);shRNA-Rad51组的γ-H2AX阳性率为(27.48±1.66)%,与Control组的(14.77±1.21)%及shRNA-NC组的(14.04±1.31)%比较,差异均有统计学意义(P <0.01);shRNA-Rad51组的BRCA1蛋白表达水平为(0.25±0.03),与Control组的(0.55±0.04)及shRNA-NC组的(0.51±0.04)比较,差异均有统计学意义(P <0.01);shRNARad51组的53BP1蛋白表达水平为(3.24±0.27),与Control组的(2.01±0.19)及shRNA-NC组的(2.11±0.17)比较,差异均有统计学意义(P <0.01)。结论 Rad51基因沉默后,TK6细胞HR修复通路受抑制和NHEJ修复通路激活,TK6细胞对铅遗传毒性的敏感性增强。

miR-7-5p对氢醌诱导TK6细胞损伤作用

目的通过慢病毒技术构建miR-7-5p稳定过表达的人淋巴母细胞TK6细胞株,探讨miR-7-5p对氢醌诱导TK6细胞损伤的作用机制。方法 (1)构建miR-7-5p过表达慢病毒载体,转染TK6细胞,经嘌呤霉素筛选获得miR-7-5p稳定过表达TK6细胞株(TK6-miR-7-5p细胞)和阴性空载体对照TK6细胞(TK6-NC细胞),采用实时荧光定量聚合酶链式反应鉴定构建效果。(2)以终浓度为0和40μmol/L的氢醌分别处理TK6细胞、TK6-NC细胞和TK6-miR-7-5p细胞48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率;采用免疫印迹法检测以终浓度为40μmol/L的氢醌处理的3种细胞中PARP-1和BRCA1蛋白的相对表达水平。结果 (1)成功筛选出稳定过表达miR-7-5p的TK6细胞株;与正常TK6细胞比较,TK6-miR-7-5p细胞中miR-7-5p的相对表达水平升高约17倍(P<0.01),但细胞形态未出现明显改变。(2)予浓度为40μmol/L氢醌处理3种细胞后,与正常TK6细胞和TK6-NC细胞比较,TK6-miR-7-5p细胞存活率下降(P<0.01),细胞早期凋亡率增加(P<0.01),PARP-1和BRCA1蛋白相对表达水平均下降(P<0.05)。结论 miR-7-5p可能通过抑制PARP-1和BRCA1的DNA损伤修复能力而导致氢醌诱导TK6细胞早期凋亡增加。

不同君药四君子汤辐射损伤防护作用的比较研究

目的研究不同君药四君子汤对受照人淋巴母细胞AHH-1及小鼠的辐射损伤防护作用,探讨不同君药及不同配比对四君子汤抗辐射活性的影响。方法使用CCK-8试剂盒检测不同终浓度的3种四君子汤作用48 h对AHH-1细胞的毒性作用,以及不同终浓度的四君子汤预处理AHH-1细胞2 h后对经4 Gy^(60)Coγ射线照射的细胞存活率的影响。使用6~8周的BALB/C小鼠120只,用随机数字表法分为阴性对照组、照射对照组以及人参四君子汤(10:9:9:6)组、人参四君子汤(2:2:2:1)组、党参四君子汤(2:2:2:1)组。3.5 Gy^(60)Coγ射线全身单次照射造成小鼠电离辐射损伤模型。照射后3 d和7 d,观察不同君药、不同配比的四君子汤对细胞、辐射损伤模型小鼠的体重、胸腺系数、脾脏系数、微核、脾细胞凋亡等活性指标的影响。结果 250μg/mL的党参四君子汤(2:2:2:1)可显著提高受照AHH-1的存活率(P<0.05);人参四君子汤(2:2:2:1)、党参四君子汤(2:2:2:1)能够有效促进照后3d小鼠体重的恢复(P<0.05);人参四君子汤(10:9:9:6)可显著提高照后7d小鼠的胸腺系数、显著降低照后3d的骨髓嗜多染红细胞微核率及照后3 d、7 d的脾细胞凋亡率。党参四君子汤(2:2:2:1)可显著降低照后3 d、7 d的脾细胞凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率。人参四君子汤(2:2:2:1)可显著升高照后7d的胸腺、脾脏系数,显著降低照后3 d、7 d的脾细胞凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率。结论相同配比下,人参作为君药,抗辐射药效优于党参;不同配比下,人参(2:2:2:1)抗辐射药效优于人参(10:9:9:6)。该实验结果验证了四君子汤方中人参作为君药以及药物配比为2:2:2:1的合理性,同时也验证了党参四君子汤及10:9:9:6的药物配比在辐射损伤防治方面也起到一定的作用。