中国4个弓形虫虫株GRA6基因的比较分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原(GRA6)基因进行PCR-RFLP分析,首次对中国弓形虫虫株进行了基因分型研究,旨在了解中国弓形虫基因型的分布情况,从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。PCR-RFLP分析显示两种带型:RH、SH、CN3株弓形虫为一种带型,QH和ZS2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示:RH、SH、CN3株弓形虫的GRA6基因序列上的MseΙ酶切位点与国外报道的RH株一致,同属于基因型Ι,为强毒株;QH和ZS2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY株和ME49株一致,同属于基因型Ⅱ,与PCR-RFLP分析结果一致。除MseΙ酶切位点外,中国的几个虫株GRA6序列与GenBankTM注册的RH株及BEVERLEY和ME49两个弱毒株有个别碱基的差异。结果证明中国人源弓形虫包含了Ι、Ⅱ两种基因型,而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ι、Ⅱ两个基因型。

人源中国Ⅲ型刚地弓形虫分离株在终末宿主内的发育研究

目的建立人源中国Ⅲ型弓形虫LHG株体外感染猫肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)体系及体内感染开启有性生殖实验动物模型,观察其在不同感染条件下在终末宿主细胞内的发育情况。方法人源中国Ⅲ型LHG弓形虫分离株经口感染昆明KM小鼠42d成囊后,采用Percoll梯度离心法纯化脑组织包囊,经0.25%m/v胰酶消化释放缓殖子后体外感染猫IECs(1∶10,虫株:IECs)。取含有弓形虫包囊的KM鼠脑组织显微镜下计数,按600个包囊/只经口感染5只3月龄健康家猫,每天收集猫粪便,分别采用镜检及PCR扩增弓形虫特异性529bp重复序列及B1基因检测弓形虫卵囊排泄情况,采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光(immunofluorescence assay,IFA)鉴定感染猫小肠内裂殖子的发育,分析中国Ⅲ型虫株的体内有性生殖规律。结果LHG弓形虫分离株缓殖子在体外条件下可成功黏附、入侵猫IECs,在细胞内形成“玫瑰花”样结构,4~5d细胞破裂释放虫体,完成无性生殖过程,但未检测到与有性生殖相关的裂殖体、雌雄配子体及合子,且其体外黏附入侵宿主细胞效率显著低于Ⅰ型RH株;但其感染5只猫后,4~6d猫粪便内均检测到弓形虫卵囊,其小肠经IHC和IFA检测在IECs内均出现裂殖体样结构,说明成功开启了有性生殖过程,且效率高于自然条件下的既往报道数据。结论成功建立了中国Ⅲ型弓形虫LHG株体外感染猫IECs体系及高效开启有性生殖实验动物模型,证实该虫株是我国猫科动物的易感虫株,为研究弓形虫有性生殖机制及研制阻断弓形虫卵囊排泄传播药物及疫苗奠定基础。