浙江省首例14型猪链球菌人源分离株鉴定及分子特征分析

目的对浙江省首例14型猪链球菌菌株进行综合鉴定与分子分型特征研究。方法对目标菌株进行镜检、生化、血清学玻片凝集试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴定,同时利用聚合酶链(PCR)技术检测该菌株链球菌属(tuf)、猪链球菌种(16S rRNA)、猪链球菌血清型基因以及毒力基因,另采用脉冲场凝胶电泳技术(pulsed-fieId gel electrophoresis,PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)以及最小核心基因组群(minimum core genome groups,MCG群)方法分别对菌株进行分子分型检测。结果传统细菌学方法和质谱鉴定技术以及核酸检测均将这株人源分离株鉴定为14型猪链球菌;25种毒力基因检测,除salKR与89K PAI基因检测为阴性,其它均为阳性;分子分型检测该菌株为高致病性ST1及MCG Group1型,PFGE检测结果表明此菌株同浙江省主要流行毒力株在同一主分支,相似性达94.95%。结论本次检出14型人源猪链球菌强毒力株,属高致病基因型ST1/MCG Group1型菌株,属浙江省首次报道,今后应密切关注省内该型别菌株流行趋势。

浙江省猪链球菌2型人源分离株分子分型特征

目的了解浙江省猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的分子分型特征。方法对浙江省2005年1月至2021年7月29株散发SS2人源分离株进行基因分型检测,采用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),以及最小核心基因组(minimum core genome,MCG)群方法,分别进行分型检测。结果29株菌株经PFGE得到10种PFGE图谱带型,3个主要分支簇群,其中21株(72.41%)被分成2个主要分支群,8株(27.59%)呈遗传多样性,相似性为49.7%~94.7%。29株菌株经MLST得到3种序列型,其中ST7型25株(86.21%),ST1型3株(10.34%),ST25型1株(3.45%)。29株菌株得到3个MCG基因型,其中E型12株(41.38%),Group1型16株(55.17%),Group4型1株(3.45%)。结论浙江省SS2主要流行两大克隆群高致病株,少数菌株传播过程中可能存在遗传变异,进化分析呈遗传多样性。

伪狂犬病病毒荧光标签毒株构建及其在抗病毒药物筛选中的初步应用

为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白mCherry的荧光标签毒株PRV-mCherry。基于构建的荧光标签病毒,以荧光强度为指标,建立高通量药物筛选平台,对天然产物库中1621种化合物进行抗病毒药物筛选,并初步探索药物特性。结果表明,mCherry标签插入位置正确且稳定遗传,荧光标签毒株PRV-mCherry与亲本毒株在PK-15细胞上的增殖曲线趋势一致,且荧光强度可反映病毒增殖情况。使用PRV-mCherry从天然产物库中成功筛选出3种可在体外有效抑制PRV增殖的药物,根据测定的50%细胞毒性浓度和50%抑制浓度,计算出3种药物的选择指数范围为203.63~564.58μmol·L^(-1),表明其具有良好的成药性。本研究为临床防治PRV感染的抗病毒药物发掘提供了新的策略和思路。

人源中国Ⅲ型刚地弓形虫分离株在终末宿主内的发育研究

目的建立人源中国Ⅲ型弓形虫LHG株体外感染猫肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)体系及体内感染开启有性生殖实验动物模型,观察其在不同感染条件下在终末宿主细胞内的发育情况。方法人源中国Ⅲ型LHG弓形虫分离株经口感染昆明KM小鼠42d成囊后,采用Percoll梯度离心法纯化脑组织包囊,经0.25%m/v胰酶消化释放缓殖子后体外感染猫IECs(1∶10,虫株:IECs)。取含有弓形虫包囊的KM鼠脑组织显微镜下计数,按600个包囊/只经口感染5只3月龄健康家猫,每天收集猫粪便,分别采用镜检及PCR扩增弓形虫特异性529bp重复序列及B1基因检测弓形虫卵囊排泄情况,采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光(immunofluorescence assay,IFA)鉴定感染猫小肠内裂殖子的发育,分析中国Ⅲ型虫株的体内有性生殖规律。结果LHG弓形虫分离株缓殖子在体外条件下可成功黏附、入侵猫IECs,在细胞内形成“玫瑰花”样结构,4~5d细胞破裂释放虫体,完成无性生殖过程,但未检测到与有性生殖相关的裂殖体、雌雄配子体及合子,且其体外黏附入侵宿主细胞效率显著低于Ⅰ型RH株;但其感染5只猫后,4~6d猫粪便内均检测到弓形虫卵囊,其小肠经IHC和IFA检测在IECs内均出现裂殖体样结构,说明成功开启了有性生殖过程,且效率高于自然条件下的既往报道数据。结论成功建立了中国Ⅲ型弓形虫LHG株体外感染猫IECs体系及高效开启有性生殖实验动物模型,证实该虫株是我国猫科动物的易感虫株,为研究弓形虫有性生殖机制及研制阻断弓形虫卵囊排泄传播药物及疫苗奠定基础。