人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞治疗急性B淋巴细胞白血病的临床研究

目的:研究人源化CD19 CAR-T细胞治疗难治/复发性B-ALL患者的安全性和有效性。方法:入组的患者为15例既往未接受鼠源CD19 CAR-T细胞治疗的复发/难治的B-ALL儿童和成人患者。患者在氟达拉滨和环磷酰胺为基础的预处理化疗后,接受了1×10^6/kg的自体人源化CD19 CAR-T(Hcart19)细胞的输注。在患者回输CAR-T细胞后观察其治疗的安全性及有效性。结果:15名患者中,13/14(92.9%)可评价的患者在Hcart19输注后30 d获得了完全缓解(CR)或者CR伴血细胞不完全恢复(Cri)。180 d时总生存率及无病生存率分别达到73.3%和69.2%。累积复发率及非复发死亡率分别是24.5%和7.7%。15例患者中有12名患者(80%)发生了1-2级的细胞因子释放综合征(CRS),3名患者(20.0%)发生了3-5级的CRS,而只有1名患者(6.7%)发生了可逆性神经毒性。结论:hCART19s可有效治疗复发/难治的成人及儿童B-ALL患者,且治疗相关的CRS及神经毒性发生率较低。

嵌合抗原受体细胞免疫疗法在治疗HIV感染中的研究进展

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CAR)是一种人工合成的受体,以不依赖主要组织相容性复合体的方式靶向结合表面抗原。CAR由决定目标特异性的单链可变片段(single-chain variable fragments,scFv)、连接scFv到信号域的细胞外结合结构域、跨膜域和细胞内信号域组成,其中细胞外结合结构域的识别序列决定了CAR特异性及其与目标抗原的亲和力。

人源化与鼠源CD19嵌合抗原受体-T细胞对急性淋巴细胞白血病细胞及其移植瘤的杀伤活性比较

目的比较人源化CD19嵌合抗原受体(CAR)-T细胞与鼠源CD19 CAR-T细胞的功能。方法收集8名健康志愿者的外周静脉血T细胞,行人源化和鼠源CD19 CAR慢病毒感染,制备人源化和鼠源CD19 CAR-T细胞,采用细胞计数8法检测细胞增殖情况。以急性淋巴细胞白血病Nalm-6细胞作为靶细胞,采用乳酸盐脱氢酶法检测对照CD^(3+)T细胞、人源化及鼠源CD19 CAR-T细胞的细胞杀伤活性。将30只Nalm-6细胞荷瘤裸鼠采用随机区组法随机分为3组,每组10只,分别经尾静脉注射人源化CAR-T细胞、鼠源CAR-T细胞和对照CD^(3+)T细胞悬液。采用流式细胞术检测内眦静脉血Nalm-6细胞占外周血细胞比例和CD19 CAR-T细胞占T细胞比例。观察裸鼠的生存时间。结果体外培养24 h,鼠源和人源化CAR-T细胞的增殖率分别为(68.50±0.93)%和(80.63±1.41)%,差异有统计学意义(t=20.353,P<0.001);共培养48 h时,分别为(91.38±1.41)%和(148.13±1.25)%,差异亦有统计学意义(t=85.364,P<0.001)。效靶比为1∶1时,共培养24 h,人源化CD19 CAR-T细胞组与鼠源CD19 CAR-T细胞组对Nalm-6细胞的杀伤活性差异无统计学意义(P=0.169);共培养48 h,人源化CD19 CAR-T细胞组对Nalm-6细胞的杀伤活性高于鼠源CD19 CAR-T细胞组(P<0.01)。效靶比为4∶1时,共培养24和48 h,人源化CD19 CAR-T细胞组对Nalm-6细胞的杀伤活性均高于鼠源CD19 CAR-T细胞组(均P<0.01)。CAR-T细胞治疗第7天,人源化CD19 CAR-T细胞组、鼠源CAR-T细胞组裸鼠外周血中Nalm-6细胞比例下降至最低;21 d后,鼠源CAR-T细胞组裸鼠体内Nalm-6细胞比例高于人源化CAR-T细胞组(P_(21 d)=0.001,P_(28 d)<0.001,P_(35 d)<0.001)。人源化CD19 CAR-T细胞组和鼠源CAR-T细胞组裸鼠外周血中CAR-T细胞比例均于CAR-T细胞治疗第7天达到峰值,人源化CD19 CAR-T细胞组高于鼠源CAR-T细胞组(P_(7 d)=0.002)。鼠源CAR-T细胞组裸鼠外周血中CAR-T细胞于第14天消失,人源化CAR-T细胞组裸鼠外周血中CAR-T细胞至第21天消失。鼠源CAR-T细胞组和人源化CD19 CAR-T细胞组裸鼠的中位生存时间分别为42和63 d,差异有统计学意义(χ^(2)=15.382,P<0.001)。结论人源化CD19 CAR-T细胞比鼠源CD19 CAR-T细胞增殖能力强、对急性淋巴细胞白血病细胞的杀伤活性高、体内存留时间长,用于急性淋巴细胞白血病的临床疗效可能会优于鼠源CD19 CAR-T细胞。

一种新的人源化抗CD19嵌合抗原受体NK细胞的制备和对体外肿瘤细胞杀伤作用

目的:构建人源化抗CD19嵌合抗原受体NK细胞(hCAR19-NK),并且在体外证明其对CD19阳性血液病肿瘤细胞杀伤作用。方法:构建人源化的第二代CD19 CAR的逆转录病毒载体,使用辐照的K562-4-1BBL-mIL21细胞刺激外周血来源的NK细胞,通过逆转录病毒转导NK细胞获得hCAR19-NK细胞;采用流式细胞术和Western blot检测转导效率;采用4 h荧光杀伤实验和ELISA法检测hCAR19-NK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤能力和IFN-γ释放水平;采用CD107a脱颗粒实验评估淋巴瘤细胞对hCAR19-NK细胞的特异性激活;比较对照组(Mock)和hCAR19-NK组细胞扩增倍数。结果:流式细胞术和Western blot证明构建的CAR可以成功转导外周血来源的NK细胞;4 h荧光杀伤实验证明随着效靶比例升高,hCAR19-NK对Raji-GL杀伤率增加,明显高于Mock组;ELISA法检测显示Raji和K562-CD19作为靶细胞时,hCAR19-NK细胞的IFN-γ释放明显高于Mock组(P<0.01);CD19+细胞(Raji和K562-CD19)可以特异性刺激hCAR19-NK细胞表达CD107a,具有统计学意义(P<0.05);Mock组和hCAR19-NK组细胞扩增倍数无显著差异。结论:成功构建了可以杀伤CD19+肿瘤的人源化scFv的第二代hCAR19-NK细胞。

人源化靶向CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治急性B淋巴细胞白血病的有效性及安全性

目的观察人源化靶向CD19嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗复发/难治急性B淋巴细胞白血病(R/R B-ALL)患者的有效性及安全性。方法分析2020年2月至2021年7月于浙江大学医学院附属第一医院接受人源化靶向CD19 CAR-T细胞治疗的41例R/R B-ALL患者的有效性和安全性。结果中位第15(9~47)天,41例患者的完全缓解率为95.1%(39/41),其中38例患者骨髓经流式细胞术检测微小残留病灶阴性。39例完全缓解的患者中17例未接受进一步治疗,70.6%(12/17)的患者在随访结束时仍处于缓解状态,输注最早的两例患者无进展生存期达12.6个月;另外17例患者缓解后行巩固性造血干细胞移植(10例)或CD22 CAR-T细胞序贯治疗(7例),76.5%(13/17)的患者在随访结束时仍处于缓解状态;其余5例患者未接受巩固性治疗,在CAR-T细胞治疗后中位第72(55~115)天复发。1年总生存率为73.6%(95%CI 55.2%~92.3%),1年无进展生存率为56.2%(95%CI 38.1%~75.2%)。所有患者均发生了细胞因子释放综合征,63.4%(26/41)为1~2级。3例患者发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征。结论人源化靶向CD19 CAR-T细胞能有效诱导R/R B-ALL患者获得完全缓解,且不良反应可耐受。

人源化与鼠源CD19 CAR-T细胞疗法治疗复发/难治急性B淋巴细胞白血病的长期随访

目的探索人源化和鼠源CD19嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗复发/难治急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)安全性、短期及长期随访的疗效差异。方法分析2016年5月至2023年3月于华中科技大学同济医学院附属协和医院接受CD19 CAR-T细胞治疗的80例R/R B-ALL患者的有效性和安全性,其中接受鼠源CAR-T治疗31例,人源化CAR-T治疗49例。结果鼠源和人源化组患者发生细胞因子释放综合征(CRS)的比例分别为61.3%和65.3%,其中接受鼠源CAR-T的患者发生重症CRS的比例高于人源化CAR-T(19.4%对8.2%,P=0.174),两组中分别有1例患者死于严重CRS。1~2级免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)的发生率为12.9%和6.1%,无患者发生高级别ICANS。鼠源组和人源化组中白血病患者的总体反应率分别为74.2%和87.8%。在中位时间为10.5个月的随访期中,两组患者中位无复发生存(RFS)期均为12个月,中位总生存(OS)期均未达到。在45例基线骨髓白血病细胞负荷>20%的患者中,接受人源化CAR-T治疗的患者1年PFS率显著高于鼠源组(43.25%对33.33%,P=0.027)。桥接移植是改善B-ALL患者OS(χ^(2)=8.017,P=0.005)及RFS(χ^(2)=6.584,P=0.010)的独立影响因素。常见高危因素(年龄、骨髓高肿瘤负荷、BCR-ABL融合基因)对长期随访结果无显著影响。3例人源化组患者多次回输后仍达完全缓解,1例鼠源组患者复发后二次回输鼠源CAR-T细胞RFS期仅1个月。结论与接受鼠源CAR-T疗法治疗的患者相比,人源化CAR-T在不影响安全性的前提下,在高肿瘤负荷患者中显示出更持久的疗效,并有效克服免疫原性导致的CAR-T耐药,为多次复发患者提供治疗选择。

一种新的高亲和力的人源化抗CD19CAR-T细胞的构建及体外功能验证

目的构建人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），通过体外实验验证其杀伤白血病细胞的能力。方法将人CD19的鼠源抗体（FMC63）进行了人源化改造，获得高亲和力的人源化CD19抗体；构建携带人源化CD19CAR慢病毒载体，感染T细胞获得人源化CD19CAR-T细胞（hCART19）；按不同效靶比将效应细胞[hCART19、未转染的T细胞（阴性组）及对照病毒转染的T细胞（对照组）]及靶细胞（CHO-K1-CD19及Raji细胞）混合培养，LDH释放实验及ELISA法检测hCART19杀伤白血病细胞的能力及细胞因子释放水平；白血病小鼠模型检测hCART19的杀瘤效果。结果LDH释放实验证实随着效靶比的不断增加，对靶细胞的杀伤率逐渐增加，当效靶比为10：1时hCART19组的杀伤率最大，在Raji细胞中为（87．56±1．99）％，明显高于阴性组[（19．31±1．16）％]及对照组[（21．35±1．19）％]（P值均〈0．001）。ELISA法检测显示Raji细胞作为靶细胞时，hCART19组IL-2水平[（10．56±0．88）pg／ml]及IFN-γ[（199．02±12．66）pg／ml]较阴性组[IL-2：（3．55±0．26）pg／ml；IFN-γ：（37．63±0．85）pg／ml]及对照组[IL-2：（2．92±0．32）pg／ml；IFN-γ：（52．07±3．33）pg／ml]明显升高（P值均〈0．001）。以上实验在CHO-K1-CD19细胞作为靶细胞时也出现了相似的结果。给予白血病小鼠模型尾静脉分别注射hCART19、对照病毒转染的T细胞及未转染的T细胞，结果显示hCART19组小鼠存活时间〉40d，另外两组小鼠在20～30d全部死亡，差异有统计学意义（χ2=11．73，P=0．008）。结论成功构建了具有抗白血病活性的人源化CD19CAR-T细胞，为下一步的临床研究奠定了基础。

人源化BCMA CAR-T细胞挽救治疗鼠源BCMA CAR-T细胞治疗后再进展的难治多发性骨髓瘤二例

目的探讨人源化B细胞成熟抗原(BCMA)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗鼠源BCMA CAR-T后疾病再进展的难治性多发性骨髓瘤(RRMM)患者临床疗效及安全性。方法采集两例患者自体外周血单个核细胞,制备BCMA CAR-T细胞,FC方案(氟达拉滨+环磷酰胺)预处理后分别予鼠源/人源化BCMA CAR-T细胞输注。输注后监测CAR-T细胞扩增、细胞因子变化及不良反应。体外试验检测鼠源/人源化BCMA CAR-T转染效率、对MM细胞株的杀伤活力及炎症细胞因子释放水平。结果例1及例2输注鼠源CAR-T后3个月分别为完全缓解(CR)及疾病稳定(SD)。16个月及18个月后出现疾病再进展,且例1出现髓外病变,输注人源化BCMA CAR-T细胞挽救治疗后,分别达到部分缓解(PR)及非常好的部分缓解(VGPR)的疗效,例1髓外病变4个月消失。两例患者在人源化BCMA CAR-T细胞治疗期间,CAR-T细胞体内扩增峰值、体内持续时间均较鼠源输注期间水平升高。人源化BCMA CAR-T治疗期间IL-6、IL-8、IFN-γ、IL-10及TNF-α峰值高于鼠源CAR-T峰值。两例患者输注鼠源CAR-T期间细胞因子释放综合征(CRS)均为1级,无神经系统毒性(ICANS);人源化CAR-T治疗例1 CRS为3级,ICANS为2级,支持对症治疗后好转,例2 CRS 2级,无ICANS发生。体外试验证实48 h效靶比为1∶1时,人源化BCMA CAR-T、鼠源CAR-T细胞分别与例1、例2患者共培养,BCMA+肿瘤细胞残余比例分别为(17.38±5.18)%对(28.27±4.58)%、(13.25±1.62)%对(22.77±1.77)%,人源化BCMA-CAR-T对原代MM的细胞毒作用优于鼠源CAR-T细胞(P<0.001),且IFN-γ、TNF-α及IL-6释放水平均高于鼠源CAR-T细胞(P值均<0.001)。结论鼠源BCMA CAR-T治疗后复发进展的RRMM患者再次输注人源BCMA CAR-T可能有效且安全性可控。

人源化CD19 CAR-T细胞治疗儿童及青少年复发难治急性淋巴细胞白血病患者的疗效及安全性

目的探讨人源化CD19 CAR-T细胞(hCART19s)治疗儿童及青少年复发、难治性急性淋巴细胞白血病(R/R ALL)的疗效及安全性, 研究影响其预后的相关因素。方法筛选2016年5月至2021年9月徐州医科大学附属医院入组NCT02782351临床试验中31例25岁以下儿童及青少年R/R ALL患者的临床资料, 评价hCART19s在年轻患者中的疗效及安全性。结果 hCART19s输注后1个月, 短期疗效评估显示27例(87.1%)患者获得完全缓解(CR)或完全缓解兼部分血细胞计数缓解(CRi)。治疗期间, 20例(64.5%)患者出现1~2级细胞因子释放综合征(CRS), 4例(12.9%)出现3~4级CRS;2例患者出现1级神经系统毒性。中位随访19.3(2.2~62.4)个月, 中位无事件生存(EFS)率和总生存(OS)率分别为15.7(95%CI 8.7~22.5)个月和32.2(95%CI 10.6~53.9)个月。桥接移植患者EFS和OS率均高于未桥接移植患者[EFS:(75.0±12.5)%对(21.1±9.4)%, P=0.010;OS:(75.0±12.5)%对(24.6±10.2)%, P=0.012];既往治疗线数>3次的患者EFS和OS率明显低于治疗线数≤3次的患者[EFS:0对(49.5±10.4)%, P<0.001;OS:0对(52.0±10.8)%, P<0.001]。截止随访终点, 13例患者出现CD19阳性(CD19+)复发, 1例出现CD19阴性(CD19-)复发。结论 hCART19s可有效治疗儿童及青少年R/R ALL患者, 其严重不良事件发生率较低。桥接移植、治疗线数可对患者长期疗效及预后产生影响。

基因工程小分子抗体在抗病毒疾病中的研究进展

1.概述近年来,基因工程技术和蛋白工程技术得到了飞速发展。人类应用这些高新技术制备出了新一代抗体——基因工程抗体。由初始的鼠一人嵌合抗体到随后的单域抗体,单链抗体,重构人源化抗体等。这新一代抗体的产生都是在尽最大可能地制备出可安全、有效地用于人体内进行诊断、治疗的新型抗体制剂。基因工程抗体制备快速,成本低廉,为抗体成为新型的常规临床制剂打下了良好的基础。

靶向CD19治疗急性B淋巴细胞白血病的研究进展

急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)是急性淋巴细胞白血病最常见的类型,目前治疗以化疗为主,但具有严重的不良反应。CD19普遍在B系恶性肿瘤中高表达,并在B细胞信号转导、活化以及发育等过程起关键作用,成为B细胞恶性肿瘤治疗的有效靶点之一。目前开发了多种靶向CD19的疗法,包括抗体药物偶联物、单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体细胞疗法等。文章就近年靶向CD19治疗B-ALL的临床试验研究进展进行综述。