人源化抗人TNF-α单克隆抗体在转基因小鼠体内的药效学实验

目的研究人源化抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(recombinant humanization anti-human tumor necrosis factorαmonoclonal antibody,rhTNF-McAb)对人TNF-α转基因小鼠自发性关节炎的治疗作用。方法以市售药物Adalimumab为阳性药物,通过给予不同剂量的rhTNF-McAb对转基因小鼠的自发性足肿胀度、小鼠四肢综合肌力和踝关节组织病理学变化,用ELISA法检测小鼠体内人TNF-α质量浓度、血药质量浓度和抗药物抗体质量浓度。结果rhTNF-McAb(0.5 mg·kg^(-1),1.5 mg·kg^(-1),4.5 mg·kg^(-1))腹腔给药对人TNF-α转基因小鼠的自发性足肿胀有显著的治疗作用,并呈现明显的剂量依赖性关系,作用机制与阳性药物Adalimumab一致。但rhTNF-McAb在小鼠体内的清除情况,产生抗药物抗体的滴度与Adalimumab明显不同。结论rhTNF-McAb可以显著的抑制人TNF-α,并且其疗效更优于已上市类似药物Adalimumab。

抗人Ⅰ型干扰素受体亚基1人源化单克隆抗体的制备和鉴定

Ⅰ型干扰素在系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用,采用抗体阻断其信号转导通路具有潜在的治疗作用。本研究以人Ⅰ型干扰素受体亚基1(IFNAR1)重组蛋白为抗原免疫新西兰白兔,采用B细胞克隆技术筛选兔抗人IFNAR1单克隆抗体,经过人源化改造获得QX006N。体外研究结果显示,QX006N能特异性地结合人IFNAR1,亲和力约108 pmol/L,可阻断Ⅰ型干扰素信号通路及其介导的生物学效应。本研究为开发靶向干预Ⅰ型干扰素信号途径用于治疗SLE的抗体药物提供了坚实的基础。

注射用人源化抗人TNF-α单克隆抗体在中国健康成年志愿者中抗药性抗体的产生对其药代动力学行为的影响

目的研究人源化抗人TNF-α单克隆抗体在中国健康成年志愿者中单次皮下注射后,产生的抗药性抗体(ADA)对其药代动力学的影响。方法 60例健康志愿者分为6个递增剂量组,每组依次单次腹部皮下注射人源化抗人TNF-α单克隆抗体5,15,30,50,75或100 mg,测定给药前、给药后第4,12,24,36,48,60,72,96,120,144,168,216,264,312,360,408,456,504,576和672 h的血药浓度,以及给药前、给药后168、360、504和672 h的ADA。结果 5～100 mg剂量组ADA阳性率分别为100%,100%,100%,80%,90%和70%,总体阳性率高达90%。检出ADA后,ADA+者的血药浓度迅速下降,其平均血药浓度均低于ADA-者,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。ADA+者半衰期(t_(1/2))显著低于ADA-者,75～100 mg组ADA+者的清除率(CL)高于ADA-者。结论注射用人源化抗人TNF-α单克隆抗体的ADA阳性率较高,血药浓度、t_(1/2)的降低,CL的升高可能与ADA的产生有关。

重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨保护的影响

目的:观察重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效、骨保护的影响,为类风湿关节炎治疗提供更多、更积极手段。方法:选取2019年9月—2020年9月萍乡市人民医院门诊及住院就诊、确诊类风湿关节炎患者120例,按照随机数字表法分组,分为对照组和观察组。对照组为安慰剂(淀粉)+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d;观察组为重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体注射液+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d,对比疗效、关节肿胀、关节压痛、骨密度、骨钙素等成果。结果:治疗3个月后,观察组的临床总有效率高于对照组(P<0.05),红细胞沉降率、类风湿因子均低于对照组(P<0.05),观察组骨密度T值、骨钙素均优于对照组(P<0.05)。观察组关节肿胀、关节压痛个数均少于对照组,观察组VAS评分及DAS28均低于对照组(P<0.05)。在治疗期间不良反应发生率上,观察组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在甲氨蝶呤及稳定剂量泼尼松≤10 mg/d基础上,采用重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎具有良好的临床疗效,还有助于改善骨保护、骨密度指标,同时不良反应较少。

重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨代谢的影响

目的:探讨重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎(RA)临床疗效及骨代谢的影响。方法:选取2019年8月—2022年3月于萍乡市人民医院就诊并确诊RA患者60例,按随机数字表法将患者分为治疗组和对照组,各30例。治疗组采用重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗,对照组采用甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗。于治疗前和治疗3、6个月检测两组患者机体的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、骨钙素(OC)、骨密度,评估两组患者的视觉模拟评分法(VAS)评分、Sharp评分及安全性。结果:两组治疗3、6个月的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、VAS评分均明显低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月上述指标均明显低于对照组(P<0.05)。两组治疗3、6个月的OC均高于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月OC均高于对照组(P<0.05);两组治疗前后股骨颈骨密度组间和组内比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组治疗3、6个月的Sharp评分均低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月的Sharp评分均低于对照组(P<0.05)。治疗组不良事件发生率虽高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体可有效降低RA患者的C反应蛋白、类风湿因子及血沉水平,缓解其疼痛,升高OC,降低Sharp评分,且不会增加不良事件的发生,安全性较高。

治疗性人源化单克隆抗体研究进展

目前正在研究中的生物技术药物有1/4以上是单克隆抗体药物,临床治疗中人抗鼠抗体反应(HAMA)的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。因此,对于疗程长、需反复给药的单克隆抗体药物。人源化是其重要而必然的发展方向。现阶段,已有30余个通过细胞工程和基因工程制备的人源化抗体应用于临床,适应证包括变态反应性疾病、恶性肿瘤、器官移植排斥反应、心血管疾病、病毒感染等难治性疾病。此外尚有近百个人源化抗体药物正处在临床前或临床研究阶段。预计它们将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。

重组抗IgE人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效

目的通过检测肺功能来评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中Ig E水平,每2 w或4 w给予Ig E抗体皮下注射,检测患者肺功能(FVC、FEV1、FEV1/FVC%、MMEF75/25),评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。结果治疗后FVC、FEV1、FEV1/FVC%,MMEF75/25较治疗前比较差异显著(P<0.05),三组间无差异(P>0.05)。结论重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗轻中重支气管哮喘急性发作期均有效,但轻、中、重度急性治疗效果三组间无明显差异。

单克隆抗体人源化的进展及应用

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所代替,本文介绍了几种人源化抗体构建的策略和表达系统以及人源化抗体在临床方面的应用。

抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性评价方法的建立

目的建立抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性的评价方法。方法利用HER2表达阳性的人乳腺癌细胞系BT474建立抗HER2单抗体内外活性评价方法,对上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗的体外生物学活性、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性、对BT474荷瘤裸鼠的治疗作用及荷瘤裸鼠瘤体组织H E染色及免疫组化检测rh HER2mAb的分布与Herceptin进行了比较研究。结果建立了完整的该人源化单抗的体内外活性评价方法,测评结果显示,上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗在体外有效抑制BT474细胞增殖,与Herceptin体外生物学活性相似,EC50分别为148.3和145.9ng/ml;可通过ADCC效应杀伤BT474细胞,与Herceptin的EC50值一致,分别为185.0和183.9ng/ml;抑制BT474裸鼠异种移植模型肿瘤的生长,与无关抗体治疗组或PBS治疗组相比具有统计学差别(P<0.05),与Herceptin抑制能力接近,4mg/kg剂量组相比没有统计学差别;免疫组织化学检测显示抗体集中分布于肿瘤组织。结论建立的评价方法可对抗HER2单抗的抗肿瘤活性进行客观准确的评价,国内研制的抗HER2人源化单克隆抗体与进口同种抗体相比具有相同的体内外活性。

重组抗CD25人源化单克隆抗体治疗激素耐药急性移植物抗宿主病的临床研究

本研究探讨重组抗CD25人源化单克隆抗体在异基因造血干细胞移植后激素耐药的急性移植物抗宿主病(aGVHD)防治中的作用。对21例异基因造血干细胞移植后出现耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者于第1、4、8 d给予重组抗CD25人源化单克隆抗体1 mg/(kg·d)静脉输注,未达到疗效的病人间隔1周后重复本治疗。结果表明,所有患者中完全有效13例(61.9%),其中4例无病生存,8例生存伴轻度慢性移植物抗宿主病(cGVHD),1例死于白血病髓外复发;6例部分有效(28.57%),其中3例生存伴轻度cGVHD,3例死于肺部感染;2例无效(9.52%)死亡;总有效率90.5%,总生存率71.48%,尤其在单倍体造血衰竭性疾病的6例患者中,有效率高达100%。该药应用安全,未发现输注相关的毒副作用。结论:重组抗CD25人源化单克隆抗体对异基因造血干细胞移植后激素耐药的Ⅱ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)有较好的疗效,且应用安全。

鼠单克隆抗体人源化

鼠源性单克隆抗体应用于临床由于ＨＡＭＡ反应的存在而受到阻碍。以ＣＤＲ移植为核心，以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服ＨＡＭＡ反应的主要手段。

鼠源单克隆抗体人源化研究进展

杂交瘤技术诞生以来,鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用,而鼠源单克隆抗体用于疾病的治疗时却有严重的不足,单克隆抗体人源化已是当前研究的热点。对单克隆抗体人源化的有关实验研究进展进行了综述。

抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达及其产物分析

目的:研究抗人表皮生长因子受体2(HER2)人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法:合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果:表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论:实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用

采用酶联免疫吸附分析（ELISA）与基于Wil2-S细胞的流式细胞术（FCA）两种方法对生物基质中的重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh-anti-CD20zumab）进行定量分析,并对两种方法进行系统比较.方法学验证结果表明,两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度,但定量范围存在明显差异.ELISA法批内和批间精密度均小于19.5％,准确度为-18.2％～17.6％;FCA法批内和批间精密度均小于19.0％,准确度为-18.9％～ 18.4％.二者定量范围分别为0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L,ELISA法的灵敏度显著高于FCA法.利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh-anti-CD20zumab后的血药浓度-时间变化并进行药代动力学（PK）分析.结果表明,在给定剂量下,通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性.FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学（PD）研究的快捷、理想的方法.

抗人甲状腺球蛋白人源化单克隆抗体的制备

目的获得抗人甲状腺球蛋白(hTg)人源化单克隆抗体。方法从分泌抗人甲状腺球蛋白的杂交瘤细胞株hTg-60中提取总RNA,逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)扩增出鼠源性单克隆抗体hTg-60的VH及VL基因,经基因测序分析,设计出人源化抗体的基因引物,获得抗Tg单克隆抗体人源化VH及VL基因并将其克隆入真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),表达人源化抗hTg抗体。结果成功获得了6株能稳定分泌抗hTg人源化抗体的细胞株。结论为进一步获得人源化的hTg抗体及临床应用奠定了基础。

重组抗HER2人源化单克隆抗体大规模制备及活性鉴定方法学建立

目的建立大规模表达重组人源化HER2单克隆抗体(Anti-her2)并测定重组抗体活性的方法。方法利用Anti-her2重链、轻链真核表达载体质粒共同转化CHO细胞,筛选稳定表达株,然后放大培养,并利用Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、HPLC检测产物纯度,Western blot检测产物特异性,同时比较重组抗体的活性。结果筛选得到1株稳定表达的细胞株,收液后蛋白BCA定量为135.9 mg·L-1。纯化后获得的目的蛋白相对分子质量约为185 kD,蛋白纯度在99%以上,与商品化的“赫赛汀”一致;活性检测显示其活性与“赫赛汀”相当,细胞实验揭示其能显著抑制BT-474细胞增殖及胞内HER2的表达。结论该方法筛选获得的重组蛋白,与商品化药物性质基本一致,这为重组抗体药物的大规模悬浮培养放大和工业化生产奠定了基础。

人源化单克隆抗体研究进展

尽管通过几种展示文库和转基因小鼠已经可以制备人源单克隆抗体,但是人源化鼠源单克隆抗体使之用于人体治疗仍为抗体研究领域的热点。本文总结了单克隆抗体人源化的几种方法,并对其将来的发展进行了展望。

间接ELISA法测定猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的含量

目的建立猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的测定方法,为药代动力学研究提供简单快速的方法。方法采用EGFR包外区包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测抗EGFR单克隆抗体的间接ELISA法,并对其特异性、精密度、准确度、稳定性和稀释效应进行确证。结果在0.46～14.56ng·mL-1浓度范围内,测定方法具有较好的logistic曲线拟合关系,最低检测限为0.46ng·mL-1,组内及组间精密度的RSD分别为6.10%～9.81%,10.17%～11.93%。结论该方法简便、准确、特异性强,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中抗EGFR单克隆抗体的检测。

人源化单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗的研究进展

分子靶向治疗是专门针对在肿瘤发生中起关键作用的靶分子及其调控的信号转导通路,增强了抗癌治疗的特异性和选择性,避免了一般化疗药物的无选择性毒副作用和耐药性,是靶向治疗中特异性最高的层次。目前已有多种人源化单克隆抗体作为肿瘤分子靶向药物进入临床应用,临床试验证实许多靶向药物联合治疗及联合放化疗可以取得较单药治疗更为明显的疗效,而靶向药物的不良反应较轻,可以耐受。现就目前单克隆抗体在肿瘤分子靶向治疗的临床应用及其进展作一评述,并提出对这一问题的几点思考。

人源化CD25单克隆抗体对外周血T淋巴细胞活化和增殖的影响

本研究探讨人源化重组CD25单克隆抗体(rhCD25MAb)对外周血T淋巴细胞活化、增殖的影响。应用植物血凝素(PHA)刺激外周血单个核细胞,不加或同时加rhCD25MAb或环孢菌素A(CsA)进行体外培养,或先用PHA刺激T细胞活化后再加入rhCD25MAb继续进行培养。用MTT法检测淋巴细胞增殖率;流式细胞术检测T淋巴细胞表面抗原CD3、CD25的表达;ELISA方法检测细胞培养上清液中可溶性IL-2R(sIL-2R)水平。结果显示:rh-CD25MAb和CsA均能有效抑制PHA活化的T细胞的增殖,且随浓度的升高而增强,总体比较,CsA对T细胞的增殖抑制作用更强。虽然CsA和rhCD25MAb均能降低细胞培养上清中的sIL-2R的水平及CD25+/CD3+的比例,但rhCD25MAb的作用明显强于CsA。rhCD25MAb无论是在T细胞活化前还是活化后均能抑制T细胞表达CD25抗原和分泌sIL-2R。结论:rhCD25MAb具有很强的免疫抑制作用,它能抑制T细胞活化及抑制活化的T细胞增殖,临床上它不仅可用于治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD),还可用于预防aGVHD。