过氧化氢诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立

目的探讨构建过氧化氢(H_2O_2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的方法。方法不同浓度H_2O_2处理人卵巢颗粒细胞COV434,采用Western blot检测Caspase-3表达,流式细胞仪和DAPI/TUNEL双染色法检测细胞凋亡情况,H2DCF-DA检测细胞内活性氧族(ROS)水平,通过量效关系和时效关系来确定H_2O_2的最佳作用条件。结果 1~1.5 mmol/L浓度H_2O_2处理COV434细胞2~4h后Caspase-3表达量升高最明显。随着H_2O_2浓度增加及作用时间的延长细胞凋亡率不断升高。细胞内ROS水平随着H_2O_2浓度的增加而增加。1.5mmol/L浓度H_2O_2处理1h后细胞内ROS水平上升最明显。结论 H_2O_2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的最适宜浓度为1~1.5 mmol/L,采用细胞凋亡情况评价作用时间是2~4h,采用ROS评价作用时间为1h。

MAPKs和Nrf2/ARE通路调控卵巢颗粒细胞氧化应激的机制研究

目的运用过氧化氢(H_2O_2)制作人卵巢颗粒细胞(COV434)氧化应激模型,通过检测氧化应激MAPKs和抗氧化应激Nrf2/ARE通路的变化,探讨COV434氧化应激的机制。方法研究不同H_2O_2浓度(0.5、1、1.5 mmol/L)和不同作用时间(1、2、4、6及12 h)梯度下,MAPKs家族中ERK、P38及JNK蛋白及其磷酸化的表达水平,Nrf2/ARE通路中Nrf2、keap1和P62蛋白表达水平。结果在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,COV434细胞内p-ERK、p-P38、p-JNK在1 h表达最强;在不同浓度H_2O_2作用4 h后,p-ERK不随浓度的变化而变化,然而p-P38、p-JNK随浓度的增加表达增强;Nrf2蛋白表达随着H_2O_2作用时间的延长和浓度的增加逐渐增强;Keap1在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,随着时间延长蛋白表达轻度下降,而P62的蛋白表达轻度上升;在不同浓度H_2O_2作用4 h下Keap1变化不明显,而P62表达稍微增强。结论 MAPKs 3个亚族均参与了H_2O_2诱导COV434氧化应激过程,氧化应激可以诱导细胞内Nrf2的蛋白表达,提示Nrf2/ARE通路在COV434自我抗氧化中发挥作用。

Chemerin对卵巢颗粒细胞的影响及对PCOS发病机制的研究

目的:探究Chemerin在多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)发病机制中的作用。方法:体外培养人卵巢颗粒细胞(COV434),分别下调及过表达COV434细胞中的Chemerin基因,采用ELISA测定培养液炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)浓度,EdU方法测定各组细胞增殖能力,流式细胞法测定细胞凋亡。结果:下调组(LV3-shChemerin-1、LV3-shChemerin-2)与阴性对照组(LV3-NC)相比,培养液中IL-6、IL-8、TNF-α浓度均明显降低,IL-10浓度明显升高,差异均有统计学意义(PIL-6=0.006,PIL-8=0.001,PTNF-α=0.012,PIL-10=0.002),颗粒细胞COV434增殖能力明显降低(P=0.004),凋亡明显增加(P=0.000)。过表达组(LV5-Chemerin)与阴性对照组(LV5-NC)相比,培养液中IL-6、IL-8、TNF-α明显升高,IL-10明显降低,差异均有统计学意义(PIL-6=0.044,PIL-8=0.008,PTNF-α=0.015,PIL-10=0.004),颗粒细胞COV434增殖能力明显提高(P=0.013),凋亡明显降低(P=0.029)。结论:Chemerin可能通过促进卵巢颗粒细胞炎症反应,并诱导颗粒细胞增殖抑制凋亡参与PCOS的发生发展。

囊性纤维化跨膜转导因子与多囊卵巢综合征发病机制的相关性研究

目的:通过观察囊性纤维化跨膜转导因子(CFTR)对人源卵巢颗粒肿瘤细胞(COV434)增殖活力和凋亡等生物学特性的影响,探讨CFTR与多囊卵巢综合征(PCOS)排卵障碍发病机制的相关性,为PCOS提供新的病因诠释及防治靶点。方法:在CFTR特异性阻滞剂CFTRinh-172干预下,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察COV434细胞的增殖活性及凋亡情况,利用Western Blot检测COV434细胞中半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase3)蛋白、环氧化酶-2(COX-2)蛋白的表达情况,利用PCR检测肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的表达情况。结果:不同浓度(10μmol/L和50μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂作用于COV434细胞后均致其生长活力下降,且随浓度的增加其生长抑制显著,CFTRinh-172阻滞剂处理72h后的COV434细胞生长抑制率差异列更显著,抑制率与作用时间显著正相关;不同浓度(1μmol/L和10μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂作用COV434后,Cleaved-Caspase3和COX-2的蛋白表达量随浓度的增加而增加,其中,Cleaved-Caspase3的蛋白表达量在培养48h后明显高于培养24h后;添加不同浓度(1μmol/L和10μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂后,COV434中TRAIL基因的24h表达量与对照组相比呈低表达,且随着浓度的增加抑制效果更显著。结论:CFTR缺失通过Cleaved-Caspase3、COX-2及TRAIL分别影响卵巢颗粒细胞的凋亡、血管生成及卵巢内炎症反应,从而推测CFTR缺失可能是多囊卵巢综合征的卵泡发育异常的重要病理生理改变和发病机制之一。