人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的 探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法 以纯化的CEA为抗原 ,应用噬菌体表面呈现技术 ,通过 3轮亲和富集及 2轮淋巴细胞吸附实验 ,从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗 ,随机挑出 10株单克隆在大肠杆菌中进行表达 ,并采用ELISA、SDS PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果 ELISA显示有 9株单抗具有与CEA特异性结合的能力 ,挑选其中 2株具有较高亲和力的单克隆 ,经 12 %SDS PAGE蛋白电泳 ,在分子量约为 2 5kd处可见一新增蛋白带 ,与基因编码蛋白的理论计算值相符合 ,基因测序结果与GeneBank等相比对具有较高的序列同源性。结论 噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体(摘要)

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。方法:用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。材料:①SB培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨30g,酵母提取物20g,Mops 1g,pH7.0。②SOC培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨20g,酵母提取物5g,NaCl 0.5g,250mmol/L KCl溶液10ml,pH7.0。临用前加入2mol/L MgCl2溶液5ml和1mol/L葡萄糖溶液20ml。③血源纯化HBsAg。

与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞,以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞,从人源噬菌体抗体库(Griffin.1Library)经三轮筛选后,阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆,通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体,通过ABI3730全自动荧光测序仪测序,并通过GeneBank比对进行同源性分析,IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,并用IMGTVQuest软件进行分析,确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank,序列号为AY686498AY686499。结论从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体,为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定

目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定。方法将ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-stag)进行差异筛选。取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Westernblot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性。结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族。噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Westernblot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合。结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体。该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值。