表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体复性方法探索

探索表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体(Anti-CTLA4-scFv)的体外复性方法.采用稀释和透析两种复性方式,并分析影响复性得率的各种因素如复性时间、温度、适宜的氧化-还原体系对其的影响.通过非还原电泳确定复性效果,并测定蛋白含量.结果显示:含0.15 mol·L-1NaCl、1 μmol·L-1氧化型谷胱甘肽和3μmol·L-1还原型谷胱甘肽的50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液作为Anti-CTLA4-scFv的复性液,4℃下透析复性48～54 h,可获得具有天然构象的蛋白质.该方法复性蛋白得率高,从3.9 g菌体中可复性获得28 mg蛋白.

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,随机挑选 82个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定 ,获得与HCVNS4A单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCVNS4A特异性抗 IdscFv的编码基因进行序列测定分析。结果 ,经过筛选 82个克隆中有 4 0株克隆ELISA的吸光度 (A4 5 0nm)值较高 ,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应 ,确定其中有 7株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆。提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA为 789bp。本实验结果提示 ,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗 IdscFv,为开展用抗

人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用 RT-PCR 和噬菌体表面展示技术,直接从乙肝病毒核心抗体(抗 HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总 RNA,反转录成 cDNA;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因,并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因,重组于噬菌粒载体 pHEN1,转化抑制型大肠杆菌 E.coliTG1,以辅助噬菌体援救后,构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的 :筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白 (HBc)单链抗体 (ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定 ,为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法 :采用噬菌体表面展示技术 ,以乙肝病毒核心抗原为包被抗原 ,从人源性单链噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 -感染 -扩增”的筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆 ,并在大肠杆菌HB2 15 1中进行ScFv可溶性表达 ,对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果 :筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性 ,并可在大肠杆菌中进行可溶性表达 ;基因序列测定表明 ,该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符 ,轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论 :利用噬菌体抗体库技术 。

抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究

应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术 ,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值。应用噬菌体展示和基因重组技术 ,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体 ,并重组至逆转录病毒载体。以人肝癌细胞smmc - 772 1和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染 ,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg ,与对照组做比较 ,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用。结果显示 ,在急性HBV感染的细胞株中 ,抑制病毒复制效率为 4 9%～ 6 1% ,在慢性病毒感染细胞 ,抑制率为 4 1%～ 5 4 %。实验结果表明 ,应用单链抗体细胞内表达技术 ,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值。应对HBV的 4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究 ,以发现抑制效率高。

人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达

目的用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体单链抗体(singlechainFv,ScFv),并对其抗原结合特性等进行鉴定。方法利用基因重组技术对从半合成噬菌体抗体库中克隆的人源性抗角蛋白抗体Fab片段进行改造,获得了人源性抗角蛋白ScFv片段,并进行DNA序列分析。同时用ELISA法鉴定ScFv的抗原结合活性和特异性。结果DNA序列分析结果表明,单链抗体表达载体(pScFv)的Vκ和VH基因序列同Fab片段的Vκ和VH基因序列完全相同,表明在Fab片段改建成ScFv过程中未发生基因突变。可溶性表达的ScFv抗体能特异性地与角蛋白结合,而与其它抗原,如铁蛋白、胃蛋白酶、HBsAg等无关抗原不结合,说明人源性抗角蛋白Fab抗体改建为ScFv后具有较好的特异性,但可溶性表达的ScFv与角蛋白的结合活性低于可溶性Fab片段。结论成功表达并鉴定了人源性抗角蛋白的ScFv可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了基础。

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库 ,为筛选人源性抗 HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和噬菌体表面展示技术 ,直接从乙肝病毒核心抗体 (抗 HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA ,逆转录成cDNA ;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因 ,并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体 (ScFv)基因 ,重组于噬菌粒载体 pHEN1,转化抑制型大肠埃希菌E .coliTG1,以辅助噬菌体援救后 ,构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗 HBc单链噬菌体库 ,库容量达 10 6。结论 利用RT PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库 ,并达到建库标准 ,可进一步从中筛选人源性单链抗体。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.