人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建

目的构建稳定表达人源性受磷蛋白(phospholamban,PLN)的细胞系,并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用。方法采用FastCloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pcDNA5/FRT/TO(以下简称pDFT),构建pDFT-PLN-Flag质粒,并与pOG44质粒共转染Flp-In^(TM) T-REx^(TM) 293细胞,实现目的基因的表达,通过潮霉素B抗性持续压力筛选出重组成功的单克隆细胞株。应用West⁃ern印迹法和间接免疫荧光法检验重组细胞目的蛋白的表达情况。对构建成功的细胞系进行乌头碱染毒后,通过Western印迹法,检测PLN磷酸化的变化。结果重组质粒PCR扩增及DNA电泳后含有与已知PLN基因片段大小一致的扩增产物,测序后与人源性PLN基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列一致。间接免疫荧光法和Western印迹法提示构建的可增殖细胞系,诱导调控下可稳定且较高水平表达人源性PLN。乌头碱浓度为1μmol/L、染毒2 h时,PLN的Thr17位点磷酸化水平降低。结论该人源性细胞株可以稳定表达PLN,并可用于乌头碱在分子水平上对细胞影响机制的研究。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 :建立人源性永生化肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 :利用 SV4 0 L Tag基因和真核表达载体 pc DNA3.1(- )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 :经 G4 1870 0～ 30 0μg/ ml筛选 ,4 2天后获一抗 G4 18永生化肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌 AL B、ALT、AST及 LDH的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经 RT- PCR和 Western blot检测 ,转染肝细胞的 ALB m RNA阳性和细胞色素 P4 5 0 2 E1阳性。结论 :新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能。

锰对人源性脉络丛乳头状瘤细胞系合成GDF-15的影响及机制研究

目的应用人源性脉络丛乳头状瘤细胞系(hCPP)探究锰对脑脉络丛上皮细胞中生长分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)合成的影响及其调控机制。方法应用CCK-8试剂盒检测氯化锰(以下简称锰)处理后hCPP的细胞活力;不同浓度的锰(25、50、75、100、150和200μmol/L)处理hCPP细胞24、48和72 h,通过Western blot、Real-Time PCR检测GDF-15蛋白表达和Gdf-15 mRNA水平在锰作用下的剂量和时间-效应关系。给予hCPP细胞100μmol/L的锰处理24 h,通过Western blot检测p38 MAPK、NF-κB、AMPK、PI3K/AKT通路的激活情况,随后,给予相应的通路抑制剂后检测GDF-15的蛋白表达。100μmol/L的锰处理hCPP细胞0、6、12、24、36、48、72 h,检测GDF-15、p38 MAPK蛋白表达的时间-效应关系。使用荧光探针试剂盒检测hCPP锰处理(100μmol/L,24 h)后细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,给予ROS抑制剂N-acetylcysteine(NAC)后检测GDF-15、p38 MAPK蛋白表达。结果用200μmol/L以下的不同浓度的锰处理hCPP细胞24、48和72 h,可引起细胞活力降低、GDF-15蛋白合成增加、Gdf-15 mRNA水平增加,且随锰浓度的增高而变化。100μmol/L的锰处理hCPP细胞24 h,通过增加p38 MAPK、NF-κB p65和AMPKα的磷酸化水平激活p38 MAPK、NF-κB和AMPK信号通路,给予SB 202190(p38 MAPK通路抑制剂)可逆转锰处理hCPP引起的GDF-15合成增加效应。100μmol/L的锰处理hCPP细胞0、6、12、24、36、48和72 h,GDF-15蛋白水平和p38 MAPK磷酸化蛋白水平随着锰处理时间的增加而增高。100μmol/L的锰处理hCPP细胞15、30、60 min以及24 h,细胞ROS水平与对照组相比差异无统计学意义,给予NAC处理不能逆转锰引起的GDF-15合成增加及p38 MAPK通路的激活状态。结论本研究表明,锰处理可增加hCPP细胞中GDF-15的合成,这可能是p38 MAPK信号通路激活后介导的。这些发现为今后阐明GDF-15在锰所致中枢神经系统的毒性效应及分子机制提供了新的线索和科学依据。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 建立人源性肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 利用SV4 0LTag基因和真核表达载体pcDNA3.1( - )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 经G4 1870 0～30 0 μg/ml筛选 ,4 2d后获一抗G4 18肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌白蛋白 (ALB)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)及乳酸脱氢酶 (LDH)的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经逆转录聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹检测 ,转染肝细胞的ALBmRNA阳性和细胞色素P4 5 0 2E1阳性。