应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。

人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的 探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法 以纯化的CEA为抗原 ,应用噬菌体表面呈现技术 ,通过 3轮亲和富集及 2轮淋巴细胞吸附实验 ,从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗 ,随机挑出 10株单克隆在大肠杆菌中进行表达 ,并采用ELISA、SDS PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果 ELISA显示有 9株单抗具有与CEA特异性结合的能力 ,挑选其中 2株具有较高亲和力的单克隆 ,经 12 %SDS PAGE蛋白电泳 ,在分子量约为 2 5kd处可见一新增蛋白带 ,与基因编码蛋白的理论计算值相符合 ,基因测序结果与GeneBank等相比对具有较高的序列同源性。结论 噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体(摘要)

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。方法:用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。材料:①SB培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨30g,酵母提取物20g,Mops 1g,pH7.0。②SOC培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨20g,酵母提取物5g,NaCl 0.5g,250mmol/L KCl溶液10ml,pH7.0。临用前加入2mol/L MgCl2溶液5ml和1mol/L葡萄糖溶液20ml。③血源纯化HBsAg。

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。

系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析

目的构建系统性红斑狼疮(SLE)儿童个体特异性哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法采集SLE确诊患儿外周血,分离外周血淋巴细胞,提取外周血淋巴细胞总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因、构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,将抗体基因库转染293T细胞,流式细胞仪分析抗体在293T细胞表面的表达。结果以0.8μg总RNA为模板,用6套引物成功扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,构建获得的重链基因库容量为9.4×104,轻链基因库容量为8.4×104。随机挑选的10个重链克隆有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,10个轻链克隆7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析挑选的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在293T细胞表面的表达,理论上抗体库中可表达的抗体多样性可以达到109。结论以0.8μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建SLE儿童特异性全长人抗体基因库,并在293T细胞表面成功展示SLE儿童个体抗体库中的全长抗体,为进一步研究SLE儿童自身抗体的特点及自身抗体在SLE发病机制中的作用及临床应用打下良好基础。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化抗体库

目的:利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化(As)抗体细胞库,以寻找动脉粥样硬化治疗性抗体。方法:将载体pcDNA5/FRT改造成双表达载体pcDNA-DHL。分离动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA。PCR扩增抗体重链可变区和Kappa型轻链全长,连接至双表达载体pcDNA-DHL,即动脉粥样硬化抗体基因库pDHL-As,将其转染Flp-In TM-CHO细胞(FCHO),流式细胞术检测重组抗体在细胞表面的表达。加入潮霉素筛选出成功转染pDHL-As载体的细胞,即为动脉粥样硬化全长抗体细胞库。结果:成功构建双表达载体pcDNA-DHL。构建的重、轻链初库容量分别达1.79×10^5和1.80×10^5,理论上抗体库多样性为2.32×10^10。动脉粥样硬化抗体库pDHL-As可成功展示在细胞表面,并分选出45个表达抗氧化型低密度脂蛋白抗体的FCHO细胞。结论:本研究成功构建了一个动脉粥样硬化全长人源抗体细胞库。

与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞,以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞,从人源噬菌体抗体库(Griffin.1Library)经三轮筛选后,阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆,通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体,通过ABI3730全自动荧光测序仪测序,并通过GeneBank比对进行同源性分析,IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,并用IMGTVQuest软件进行分析,确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank,序列号为AY686498AY686499。结论从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体,为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。

复旦大学发现H7N9禽流感新抗体

复旦大学基础医学院应天雷课题组发现了可靶向H7N9禽流感病毒新表位的高活性抗病毒全人源抗体m826。该抗体的安全性和成药性较高,适合进一步开发为抗体药物。相关成果于《Cell Host＆Microbe》上在线发表。

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Aβ_(1-42)寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L。Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础。

从人源免疫抗体库筛选抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体

目的 获得高亲和力的全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法 以健康供血者的外周血淋巴细胞为来源,以PreS1肽体外致敏后,借助噬菌体展示技术构建人源免疫单链抗体库,库容量7×10 8。 结果 以PreS1肽进行3轮固相筛选。获得了亲和力10 7～10 8mol/L的抗PreS1单链抗体。结论 通过体外致敏的方法构建人源免疫抗体库,可以快速获得高亲和力基因工程抗体。

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定

目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定。方法将ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-stag)进行差异筛选。取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Westernblot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性。结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族。噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Westernblot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合。结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体。该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值。