人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究

为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片。用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性。用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达。结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面呈现 (phagedisplay)技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞 ,提取细胞总RNA ,通过RT -PCR方法 ,用一组人IgGFab基因特异性引物 ,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因 ,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体 pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒噬菌体抗体库 ,并用纯化的狂犬病毒颗粒和几株抗狂犬病毒鼠单克隆抗体 (单抗 )捕捉狂犬病毒抗原的方法 ,对此抗体库进行富积筛选表达 ,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达。对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析 ,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争 ,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白。其序列资料分析表明 。

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的:建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体(HuMabs)NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法:采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabs NM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果:间接ELISA法检测HuMabs NM57的灵敏度为5ng/mL,组内及组间精密度分别为2.6%～6.0%、8.5%～11.3%。结论:建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabs NM57的检测。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。

治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus,RV）引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）,基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,与病毒的毒力、致病性密切相关。

重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨保护的影响

目的:观察重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效、骨保护的影响,为类风湿关节炎治疗提供更多、更积极手段。方法:选取2019年9月—2020年9月萍乡市人民医院门诊及住院就诊、确诊类风湿关节炎患者120例,按照随机数字表法分组,分为对照组和观察组。对照组为安慰剂(淀粉)+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d;观察组为重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体注射液+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d,对比疗效、关节肿胀、关节压痛、骨密度、骨钙素等成果。结果:治疗3个月后,观察组的临床总有效率高于对照组(P<0.05),红细胞沉降率、类风湿因子均低于对照组(P<0.05),观察组骨密度T值、骨钙素均优于对照组(P<0.05)。观察组关节肿胀、关节压痛个数均少于对照组,观察组VAS评分及DAS28均低于对照组(P<0.05)。在治疗期间不良反应发生率上,观察组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在甲氨蝶呤及稳定剂量泼尼松≤10 mg/d基础上,采用重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎具有良好的临床疗效,还有助于改善骨保护、骨密度指标,同时不良反应较少。

重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨代谢的影响

目的:探讨重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎(RA)临床疗效及骨代谢的影响。方法:选取2019年8月—2022年3月于萍乡市人民医院就诊并确诊RA患者60例,按随机数字表法将患者分为治疗组和对照组,各30例。治疗组采用重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗,对照组采用甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗。于治疗前和治疗3、6个月检测两组患者机体的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、骨钙素(OC)、骨密度,评估两组患者的视觉模拟评分法(VAS)评分、Sharp评分及安全性。结果:两组治疗3、6个月的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、VAS评分均明显低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月上述指标均明显低于对照组(P<0.05)。两组治疗3、6个月的OC均高于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月OC均高于对照组(P<0.05);两组治疗前后股骨颈骨密度组间和组内比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组治疗3、6个月的Sharp评分均低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月的Sharp评分均低于对照组(P<0.05)。治疗组不良事件发生率虽高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体可有效降低RA患者的C反应蛋白、类风湿因子及血沉水平,缓解其疼痛,升高OC,降低Sharp评分,且不会增加不良事件的发生,安全性较高。

人源抗狂犬病毒中和抗体Fab091的制备及鉴定

科研人员制备出一株具有中和活性的抗狂犬病毒的基因工程中和抗体Fab,证实该抗体与狂犬疫苗联用,对狂犬病毒暴露后小鼠具有较好的保护作用。狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患急性传染病,病死率极高,发病后进展速度快,至多10天内死亡,死亡率几乎为100%。每年约有50000人和数以百万计的野生动物死于狂犬病。

重组抗IgE人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效

目的通过检测肺功能来评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中Ig E水平,每2 w或4 w给予Ig E抗体皮下注射,检测患者肺功能(FVC、FEV1、FEV1/FVC%、MMEF75/25),评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。结果治疗后FVC、FEV1、FEV1/FVC%,MMEF75/25较治疗前比较差异显著(P<0.05),三组间无差异(P>0.05)。结论重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗轻中重支气管哮喘急性发作期均有效,但轻、中、重度急性治疗效果三组间无明显差异。

人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定

目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定。方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮“吸附洗脱扩增”的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价。结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力最强者产生抗体活性为106。结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础。

抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性评价方法的建立

目的建立抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性的评价方法。方法利用HER2表达阳性的人乳腺癌细胞系BT474建立抗HER2单抗体内外活性评价方法,对上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗的体外生物学活性、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性、对BT474荷瘤裸鼠的治疗作用及荷瘤裸鼠瘤体组织H E染色及免疫组化检测rh HER2mAb的分布与Herceptin进行了比较研究。结果建立了完整的该人源化单抗的体内外活性评价方法,测评结果显示,上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗在体外有效抑制BT474细胞增殖,与Herceptin体外生物学活性相似,EC50分别为148.3和145.9ng/ml;可通过ADCC效应杀伤BT474细胞,与Herceptin的EC50值一致,分别为185.0和183.9ng/ml;抑制BT474裸鼠异种移植模型肿瘤的生长,与无关抗体治疗组或PBS治疗组相比具有统计学差别(P<0.05),与Herceptin抑制能力接近,4mg/kg剂量组相比没有统计学差别;免疫组织化学检测显示抗体集中分布于肿瘤组织。结论建立的评价方法可对抗HER2单抗的抗肿瘤活性进行客观准确的评价,国内研制的抗HER2人源化单克隆抗体与进口同种抗体相比具有相同的体内外活性。

重组抗CD25人源化单克隆抗体治疗激素耐药急性移植物抗宿主病的临床研究

本研究探讨重组抗CD25人源化单克隆抗体在异基因造血干细胞移植后激素耐药的急性移植物抗宿主病(aGVHD)防治中的作用。对21例异基因造血干细胞移植后出现耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者于第1、4、8 d给予重组抗CD25人源化单克隆抗体1 mg/(kg·d)静脉输注,未达到疗效的病人间隔1周后重复本治疗。结果表明,所有患者中完全有效13例(61.9%),其中4例无病生存,8例生存伴轻度慢性移植物抗宿主病(cGVHD),1例死于白血病髓外复发;6例部分有效(28.57%),其中3例生存伴轻度cGVHD,3例死于肺部感染;2例无效(9.52%)死亡;总有效率90.5%,总生存率71.48%,尤其在单倍体造血衰竭性疾病的6例患者中,有效率高达100%。该药应用安全,未发现输注相关的毒副作用。结论:重组抗CD25人源化单克隆抗体对异基因造血干细胞移植后激素耐药的Ⅱ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)有较好的疗效,且应用安全。

抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达及其产物分析

目的:研究抗人表皮生长因子受体2(HER2)人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法:合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果:表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论:实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用

采用酶联免疫吸附分析（ELISA）与基于Wil2-S细胞的流式细胞术（FCA）两种方法对生物基质中的重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh-anti-CD20zumab）进行定量分析,并对两种方法进行系统比较.方法学验证结果表明,两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度,但定量范围存在明显差异.ELISA法批内和批间精密度均小于19.5％,准确度为-18.2％～17.6％;FCA法批内和批间精密度均小于19.0％,准确度为-18.9％～ 18.4％.二者定量范围分别为0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L,ELISA法的灵敏度显著高于FCA法.利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh-anti-CD20zumab后的血药浓度-时间变化并进行药代动力学（PK）分析.结果表明,在给定剂量下,通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性.FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学（PD）研究的快捷、理想的方法.

间接ELISA法测定猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的含量

目的建立猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的测定方法,为药代动力学研究提供简单快速的方法。方法采用EGFR包外区包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测抗EGFR单克隆抗体的间接ELISA法,并对其特异性、精密度、准确度、稳定性和稀释效应进行确证。结果在0.46～14.56ng·mL-1浓度范围内,测定方法具有较好的logistic曲线拟合关系,最低检测限为0.46ng·mL-1,组内及组间精密度的RSD分别为6.10%～9.81%,10.17%～11.93%。结论该方法简便、准确、特异性强,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中抗EGFR单克隆抗体的检测。

人源化CD25单克隆抗体对外周血T淋巴细胞活化和增殖的影响

本研究探讨人源化重组CD25单克隆抗体(rhCD25MAb)对外周血T淋巴细胞活化、增殖的影响。应用植物血凝素(PHA)刺激外周血单个核细胞,不加或同时加rhCD25MAb或环孢菌素A(CsA)进行体外培养,或先用PHA刺激T细胞活化后再加入rhCD25MAb继续进行培养。用MTT法检测淋巴细胞增殖率;流式细胞术检测T淋巴细胞表面抗原CD3、CD25的表达;ELISA方法检测细胞培养上清液中可溶性IL-2R(sIL-2R)水平。结果显示:rh-CD25MAb和CsA均能有效抑制PHA活化的T细胞的增殖,且随浓度的升高而增强,总体比较,CsA对T细胞的增殖抑制作用更强。虽然CsA和rhCD25MAb均能降低细胞培养上清中的sIL-2R的水平及CD25+/CD3+的比例,但rhCD25MAb的作用明显强于CsA。rhCD25MAb无论是在T细胞活化前还是活化后均能抑制T细胞表达CD25抗原和分泌sIL-2R。结论:rhCD25MAb具有很强的免疫抑制作用,它能抑制T细胞活化及抑制活化的T细胞增殖,临床上它不仅可用于治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD),还可用于预防aGVHD。

一次细胞融合制备分泌抗狂犬病毒单抗杂交瘤及分泌抗独特型单抗杂交瘤的实验研究

根据独特型与抗独特型的免疫网络与免疫调节学说，利用狂犬病毒作为免疫原，设计了不同的动物免疫方案，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞经一次融合，同时获得了分泌抗狂犬病毒单克隆抗体杂交瘤及分泌狂犬病毒抗独特型单克隆抗体杂交瘤，为抗独特型抗体的制备开辟了一条简捷经济的途径。

应用双抗体夹心ELISA法定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体中的IgG含量

采用山羊抗人IgG作为包被抗体 ,辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG作为标记抗体 ,建立一种双抗体夹心法用于定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体的IgG含量。以纯化的IgG作标准 ,用平行线法测得亲和层析纯化的人源破伤风毒素单克隆抗体G2的含量为 0 .5 12 μg/ml,与分光光度法测得的结果基本一致。因而样品检测采用纯化G2作参考标准 ,制作标准曲线 ,测定了已知样品和未知样品的抗体含量。结果表明本法重复性好 ,特异性强 。

人源性抗肝癌单克隆抗体的免疫组化及细胞免疫化学研究

目的 建立人源性抗肝癌单克隆抗体细胞株，探讨其特异性。方法 用IL-2和美洲商陆（PWM）体外刺激肝癌患者外周血淋巴细胞，再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，获得3株人源性抗肝癌单克隆抗体AF3，CB7，CH1，同时进行免疫组化及细胞免疫化学研究。结果 3株人源性抗肝癌单克隆抗体AF3，CB7，CH1，可以和肝癌组织发生强阳性反应，和胃癌有微弱阳性反应，和其他3种癌组织无反应，3株单抗均能和肝癌QGY-7703细胞呈强阳性反应，与胃癌细胞有微弱阳性反应，与其他3种癌细胞反应为阴性。结论 通过人-鼠杂交瘤技术获得了3株能分泌人源性抗肝癌单克隆抗体杂交瘤细胞株，免疫组化与细胞免疫化学证实该单抗具有较好的特异性。